柱式植物葉綠體DNA提取試劑盒的品牌是百奧萊博，是優質的DNA提取純化產品，本制品用于科研目的，我公司的柱式植物葉綠體DNA提取試劑盒品質上佳，經過多年的開發生產，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括柱式植物葉綠體DNA提取試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：柱式植物葉綠體DNA提取試劑盒
英文名稱：Plant Chloroplast DNA column extraction kit
產品貨號：BTN120406
產品規格：15次

本試劑盒是結合植物葉綠體純化試劑盒和柱式植物DNA抽提試劑盒而推出的新興產品,專門用于植物葉綠體DNA的快速提取。

試劑盒特點：
1. 純度高,不含污染和抑制劑,可以直接用于酶切、PCR、real-time PCR、 mμLtiplex PCR、RAPD、RFLP、AFLP、Southern Blotting，microsatellite analysis等各種后續分子生物學實驗,不會發生離心柱堵塞現象。
2.產率一般在1-2μg/1g葉片樣品。OD260/280一般在1.8以上。DNA片段長度一般在40-50Kb左右。
3. 本產品足夠15次提取,每次可處理30g葉片。
4. 已經成功用于菠菜,大豆,萵筍,白菜,煙草和甜菜等雙子葉植物,也適用于單子葉等其他植物(可能需要優化條件)。

試劑盒組成：

成分	規格
葉綠體純化勻漿液成分一	250mL×2
葉綠體純化勻漿液成分二	3g
Percoll	60mL
帶柄尼龍濾膜	1個
葉綠體DNA純化溶液A	15mL
葉綠體DNA純化溶液B	7.5mL
葉綠體DNA純化溶液C	30mL
離心吸附柱	15套
通用洗柱液	15mL
DNA洗脫液2.0	10mL
說明書	1份

儲存條件：常溫運輸和保存(但勻漿液成分二長期保存時需要放4℃)，保存期限一年。

使用方法：
注意：葉綠體對溫度高度敏感,所以整個操作必須在冰上或者在冷室進行,所用器皿和溶液均需要在4℃預冷。離心時一定要在4℃進行,離心力以g而不是rpm計算。如果需要研究葉綠體的功能,提取還需要在昏暗的光線條件下進行。強烈建議用顯微鏡監控整個過程中葉綠體的回收情況。

一：葉綠體的純化
1.實驗前1-2天將植物放在暗室培養以減少葉綠體中淀粉顆粒的形成,否則離心時這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實驗前需先用自來水洗凈,再用蒸餾水淋洗,去掉多余水分。如果葉片采集后不能立即處理,則保存時需要保持葉片濕潤,即使如此,葉片的放置時間也不能超過一天。
2.計算實驗所需葉綠體勻漿液的體積(下面簡稱勻漿液),本試劑盒一次實驗可處理30 g葉片,對一般植物,每克葉片需要準備4mL勻漿液,則一次實驗需要準備120mL勻漿液。對煙草和大豆,每克葉片需要6mL勻漿液,則一次實驗需要準備180mL勻漿液。為了保險可以多配10%。
3.實驗當天制備勻漿液。制備方法是：將自備的去離子水與試劑盒提供的勻漿液成分一在干凈的玻璃或塑料容器中按4：1的比例混合,然后在每100mL混合液中加入勻漿液成分二干粉0.1g(終濃度為0.1%),輕柔攪拌10分鐘后,所得溶液即為勻漿液。冰上預冷待用。勻漿液只能當天使用,不能放置。
4.預留1.5mL用于懸浮葉綠體,其余勻漿液轉移到Waring勻漿機(即家用制備果汁的勻漿機)中,再快速將新鮮植物葉片的葉脈去除,再將葉片剪成1-3cm2大小的碎片,浸泡在勻漿機里面的勻漿液中。
5.低速勻漿10秒,避免起泡沫。用玻璃棒把液面的葉碎片按入到勻漿機底部,再低速勻漿10秒。
 注意：還可用Dounce玻璃勻漿器,Polytron勻漿機和研磨(加玻璃珠)等勻漿,但它們單次處理量小,需分成很多份處理后再匯集,非常不方便。
6.用帶柄尼龍濾膜過濾勻漿液,用預冷的200mL量筒收集穿透液,再等分到4個預冷的50mL的塑料離心管中(每個管中的穿透液不要超過35mL)。帶柄尼龍濾膜洗滌干凈后可反復使用。
7.在水平轉子離心機上4℃ 200g離心3分鐘(對菠菜,白菜和萵筍材料)或400g離心1分鐘(對甜菜材料),白色沉淀為未破裂的細胞或細胞核。其他植物材料則需要用戶自己摸索zuì佳離心力。
8.將上清液(含葉綠體)轉移到一個新的、預冷的50mL塑料離心管中。
9.在水平轉子離心機上4℃ 1000g離心7分鐘,小心棄上清,沉淀含葉綠體。
10.在沉淀中加入1.5mL預冷的勻漿液,手彈離心管底部使葉綠體重懸。
 注意：重懸時zuì好避免溶液起泡,也不要用槍頭吹打,否則葉綠體容易破裂。沉淀下有白色淀粉屬于正常現象,但重懸葉綠體時避免將白色淀粉重懸。
11.將4管葉綠體重懸液匯集(共約6mL),得到葉綠體粗提液。
12.如果對葉綠體DNA是否含細胞核DNA的要求不高,則葉綠體粗提液可以直接用于葉綠體DNA純化,具體操作是在水平轉子離心機上4℃ 1000g離心7分鐘,小心棄上清,沉淀為葉綠體,直接用于DNA純化(見步驟二)。
13.如果需要無細胞核DNA污染的葉綠體DNA,則按以下流程操作：在50mL塑料離心管中先加入6mL勻漿液成分一和4mL的Percoll,充分混合均勻得到40%的Percoll溶液,在其液面上小心鋪上6mL的葉綠體粗提液,在水平轉子離心機上4℃ 1700g離心6分鐘,管底綠色沉淀為完整的葉綠體,液面的綠色部分為破碎的葉綠體。小心將上清去除后,直接將沉淀(完整葉綠體)用于葉綠體DNA純化(見步驟二)。

二：葉綠體DNA的純化(溶液A和溶液B容易產生沉淀,溶液B十分粘稠,均需65℃溶解并搖勻后待用)
14.將600μL預熱的溶液A加入到葉綠體沉淀中后充分吹打混勻。
15.加入300μL預熱的溶液B,震蕩混勻10-30秒。
 注意：溶液B非常粘稠,可以采取稱量方法稱取300mg(約等于300μL)使用或將1mL槍頭剪去一截后再吸取300μL使用。
16.65℃放置3～5分鐘。如果室溫放置,DNA產量會降低10-20%。
17.加入200μL自備氯fǎng,震蕩混勻10-30秒。
18. 12000rpm室溫離心2分鐘。此時上清液將變得透明,中間層有白膜。小心轉移上清液(約0.8mL)到一個新的3-5mL離心管中,避免觸及中間層的白膜,可留少量上清不取。
19.加入1.5倍體積(約1.2mL)的溶液C,顛倒混勻后先轉移0.7mL到離心吸附柱中,室溫放置至少2分鐘。12000rpm室溫離心1分鐘,DNA將吸附在離心吸附柱的膜上,倒棄收集管中的穿透液。
20.再將剩余的溶液按上步方法上柱。
21.將0.5mL通用洗柱液加入到吸附柱中,12000rpm室溫離心1分鐘,棄穿透液。重復操作一次。空甩半分鐘去除殘留液體。
22.將離心吸附柱放置在一新的1.5mL塑料離心管中,加50-100μL DNA洗脫液2.0,室溫放置3～5分鐘。
23.12000rpm室溫離心1分鐘即得植物葉綠體DNA溶液,直接取5-10μL電泳檢測,其余放冰箱備用。

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