超級雜交液(原位雜交)由北京百奧萊博供貨并提供相關技術服務支持，本品用于科研目的，本品質量穩定，價位合理，需要超級雜交液(原位雜交)等探針標記及檢測產品的客戶，請到我公司官網聯系我們。...

特別提示：包括超級雜交液(原位雜交)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：超級雜交液(原位雜交)
英文名稱：Super hybrid solution(In situ hybridization)
產品貨號：BTN130906
產品規格：10mL

本產品為我司開發的即用型原位雜交專用核酸雜交液。既可以用于RNA原位雜交、DNA原位雜交，也可以用于FISH原位雜交等試驗。

原位雜交是在一定生物結構基礎之上的核酸雜交。這種結構基礎可以是一條染色體；一個細菌；更大結構基礎是細胞和組織?；驹硎莾蓷l核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，通過氫鍵結合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA 雙鍵分子，應用帶有標記的(有放射性同位素，如3H、35S、32P、熒光素生物素、地gāo辛等非放射性物質)DNA或RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細胞內待測核酸(RNA或DNA)片段進行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在并定位；用原位雜交技術，可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質的基因表達。此方法有很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水平來探討細胞的功能表達及其調節機制。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。

儲存條件：低溫運輸和-20℃保存、有效期一年。

使用方法：(以檢測mRNA序列為例)

培養細胞和冰凍切片
1. 玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養，條件為37℃和5%的CO2，所用培養基為DμLbecco基礎培養基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3.培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4. 30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5. 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7.預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片加20μL預雜交液(提前加入鮭魚精DNA，終濃度為100μg/ml)。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。
 注：靶DNA的變性，DNA-DNA雜交檢測中，在雜交前需要增加靶DNA的變性步驟(對mRNA的原位雜交無需此步)。樣品DNA的變性可能會造成樣品形態學的部分破壞，此步是實驗中需要優化的一個步驟。實驗時可以摸索變性時間、變性溫度等參數以獲得zuì佳條件?？梢詫⑻结樀淖冃院蜆悠稤NA變性同步進行：將樣品和探針溶液加蓋蓋玻片，置于烘箱80℃變性 ，處理5-10 min，后冷卻至37℃進行雜交。
8.雜交——按每張切片20μL雜交液(探針濃度約為1ng/μL；雜交液提前加入鮭魚精DNA，終濃度為100μg/ml)，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據雜交情況可以調節)。
9.雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃ 0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃ 0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃ 30分鐘。甩去多余液體，不洗。
11. 根據探針標記物，選擇相應顯色方法顯色、復染，脫水、封片。
12. 結果觀察。

石蠟切片
 如果有條件的話，應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時即可，較大的標本固定不要超過2小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一般不要超過1小時。
1．常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經常規脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3%檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標本新舊、厚薄自行調整)。用戶可以比較不同的消化時間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
5.其余步驟和冰凍切片6-11步相同。
6. 結果觀察。

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規格：5次
本試劑盒是基于TdT末端轉移酶能夠在DNA的3′端添加dNTP尾巴的原理而設計，該反應的示意圖如下：


產品特點：
1.快速，15分鐘即可完成標記反應。
2. 不但可用于單鏈DNA和DNA Oligo標記，還可用于3′突出的雙鏈DNA標記，但后者標記效率稍低。
3.可用同位素底物和非同位素底物(生物素和地gāo辛標記的核苷酸等)。
4. 提供不帶標記核苷酸、帶生物素標記核苷酸和帶地gāo辛標記核苷酸三種選擇。
5. 同時提供非標記的dATP，用戶可以用其調節加尾長短和標記核苷酸摻入比例。
6. 標記的探針可用于電泳遷移率實驗(EMSA)、原位雜交(ISH)、Northern Blot(不推薦用于低豐度RNA檢測)、小RNA Northern、Southern Blot(不推薦用于單拷貝基因檢測)、菌落雜交、斑點印跡雜交分析等。

試劑盒組成：

成分	規格
TdT緩沖液，5×	20μl
TdT(末端轉移酶，10U/μL)	10μl
dATP，2mM	5μl
標記核苷酸	(A、B、C不同，見注)
超純水	1ml
說明書	1份

注：A型用于自選標記，用戶需自備標記核苷酸，本產品不提供標記核苷酸；B型提供5μl Biotin-11-dUTP；C型提供含5μl DIG-11-dUTP。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
1.在0.2mL微量離心管中按下表設置一個20μl體系的標記反應(如果需要標記更多探針，請增加標記體積而不要增加探針DNA的濃度)：

成份	用量
探針DNA	100-200 pmol
TdT Buffer，5×	4μl
標記核苷酸，1mM (A型需自備標記核苷酸)	1μl
dATP，2mM	(見下注)
TdT末端轉移酶(10U/μL)	2μl
超純水	補到20μl

注：dATP可以不加，但這樣得到的加尾全部是標記核苷酸，由于空間阻礙，靈敏度不一定zuì佳。如果雜交效果不好，摻入一定比例的dATP到標記核苷酸中，以控制標記的密度，提高比活。具體比例如何可以自己優化。
2. 37℃反應15分鐘，延長到30分鐘也可以。如果沒有非標記核苷酸存在，一般可以加尾3-5個Biotin或DIG標記的核苷酸(標記物空間阻礙抑制延長)；如果有在加尾反應中加入一定比例的非標記核苷酸dATP(其他dNTP也可，只是本試劑盒只提供dATP而已)，每條探針上可加上約100個核苷酸，平均含5個標記核苷酸
3. 70℃ 10分鐘滅活TdT酶。
4. 如果需要，可以PAGE電泳+銀染(相關試劑需要另購)檢測標記效率，帶標記的探針泳動速度將低于沒標記的探針。
5. 如果是非同位素標記，探針不需純化可以直接用于雜交。如果需要純化非同位素標記的探針，請不要酚/lǜ仿抽提，因為非同位素標記物一般會使探針DNA進入有機相而丟失。
6. 使用時需將探針以1-8 ng/μL的終濃度加入到雜交液中(如果探針是雙鏈DNA，加入前還需熱變性)。如果不立即使用，非同位素標記的探針DNA可-20℃長期放置一年，同位素標記的探針DNA不能放置。

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