北京百奧萊博供應的JC-1用于科學研究，我公司專注于探針標記及檢測產品的研發、生產和供應，為您提供的JC-1質量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產品。...

特別提示：包括JC-1在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：JC-1
產品貨號：KFS163
產品規格：1mg



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名稱：5′末端同位素標記試劑盒
貨號：BTN131036
規格：20次
本產品為DNA 5′末端標記系統，利用T4 Polynucleotide Kinase(T4多聚核苷酸激酶)和［γ-32P］ATP 對粘性末端或平末端的DNA或RNA的5′末端進行標記反應。原理如下：


產品特點：
1. 使用本試劑盒之前，不需要對 5′末端的磷酸基團進行去磷酸化處理，因為使用的kinase 能使5′末端的磷酸與[γ-32P]ATP的γ-磷酸進行交換。
2. 合成的單鏈或雙寡核苷酸的5′末端游離的OH基團都能通過Kinase反應被標記(或者只是簡單的磷酸化)。
3. 提供的兩種反應液使交換反應和磷酸化反應都能進行，均能得到大于106 cpm/pmol(5′-end)的比活性。

試劑盒組份：

成分	規格
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	20μl
5×交換反應緩沖液	100μl
10×磷酸緩沖液	50μl
Control DNA	20μl
說明書	1份

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、交換反應
1. 實驗前需自備的試劑：7 M 醋酸銨、乙醇、70%乙醇等
2.在微量離心管中制備下列反應液：

成分	加入的體積
自備的5′磷酸化DNA片段	14μL(≤5 pmoles的5′末端)
5×交換反應緩沖液	5μL
[γ-32P]ATP	5μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補足到25μL

注：5 pmoles的5′末端約等于0.17μg的長100bp的雙鏈DNA。
3. 37℃反應30分鐘。
4. 70℃加熱5～10分鐘使酶失活。
5. 加入10μl的7 M CH3COONH4(pH4.5)。如使用CH3COONa做乙醇沉淀時使其終濃度達300mM。
6. 加入87.5μl(2.5倍)的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
7.離心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
8. 用適當 Buffer 溶解沉淀。
注：通過第5～8 步操作幾乎可以除去大部分未反應的[γ-32P] ATP，如要完全將其除去時，乙醇沉淀后用凝膠過濾等方法精制即可。如需用苯酚抽提除去蛋白質時，請在第8 步之后進行。

二、磷酸化反應標記

A. 去磷酸化反應
1. 實驗前需自備的試劑：TE 飽和酚/lǜ仿、3 M NaCl 、乙醇、70%乙醇、牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)等
2.在微量離心管中制備下列反應液：

成分	加入的體積
自備的DNA片段	133μL(≤10μg)
1M Tris-HCl，pH8.0	15μL
牛小腸堿性磷酸酶(CIAP，10～20U/μL)	2μl
滅菌的超純水	補足到150μL

3. 50℃反應30分鐘。
4. 加入150μl的TE 飽和酚/lǜ仿/異戊醇(25：24：1)，充分混勻。
5.離心，取上層(水層)移到另一個微量離心管中。
6. 重復操作 4～5。
7. 加入7.5μl的3 M NaCl(zuì終濃度150mM)。
8. 加入375μl(2.5倍量)的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
9.離心回收沉淀，用 1mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。
10. 使用 20μl的TE Buffer 溶解沉淀。

B. 磷酸化反應(前反應)
1.在微量離心管中制備下列反應液：

成分	加入的體積
自備的DNA片段	20.5μL(≤5 pmoles的5′末端)
10×磷酸緩沖液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補足到25μL

2. 37℃反應30分鐘。
3.下面的操作與交換反應的第4-8 步操作相同。

三、合成DNA 寡核苷酸的標記
1.在微量離心管中制備下列反應液：

成分	加入的體積
Oligonucleotide DNA with free 5′-OH(5～10 pmoles)	≤3μL
10×磷酸緩沖液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補足到25μL

2. 37℃反應30分鐘。
3.下面的操作與交換反應的第4-8 步操作相同。

四、合成DNA 寡核苷酸的標記
當摻入水平很低的時候，需要使用本步驟，即通過體積排阻色譜或過濾試劑盒除去未反應的標記。Sephadex G-50 層析柱(需另購)對于去除未摻入的dNTPs效果很好，它還能大幅減少小于20個堿基的DNA 寡核苷酸和小于20bp的雙鏈DNA的量。使用之前需要在70℃加熱5～10分鐘以使T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 層析柱可以用來純化長度不小于10個堿基的寡核苷酸。

注意事項：
1.緩沖液可在室溫融解。融解后立即置于冰中，使用前充分混勻。
2. 5×交換反應緩沖液于-20℃凍結保存時會有白色渾濁出現，但不影響反應效果。
3.酶切得到的DNA片段需經乙醇沉淀等方法純化。
4. 當用于交換反應的DNA在5 pmoles以上(約1,000bp以上)時，標記效率有時會低于106 cpm/pmol。
5. 如果交換反應所用 DNA低于500bp時，標記效率有時會有所降低。
6. 若不進行放射線標記，僅使用本試劑盒做5′末端磷酸化反應時，反應體系中的［γ-32P］ATP可用5μl的10mM ATP 代替。
7. 磷酸化反應時的［γ-32P］ATP可用［γ-35S］ATP 替代。

使用舉例：
按照使用方法中交換反應和合成DNA 寡核苷酸的標記的實驗操作，取λ-BstP I，λ-Hpa I，λ-EcoT22 I 各3 pmols，用［γ-32 P］ATP 通過正向磷酸化反應或交換反應標記。各DNA片段的放射自顯影結果如下所示：


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