Ca2+ GPCR分析-鈣離子指由北京百奧萊博供貨并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)支持，本品用于科研目的，本品質(zhì)量穩(wěn)定，價(jià)位合理，需要Ca2+ GPCR分析-鈣離子指等探針標(biāo)記及檢測產(chǎn)品的客戶，請到我公司官網(wǎng)聯(lián)系我們。...

特別提示：包括Ca2+ GPCR分析-鈣離子指示探針 Fluo-8, AM在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：Ca2+ GPCR分析-鈣離子指示探針 Fluo-8, AM
英文名稱：Fluo-8, AM
產(chǎn)品貨號(hào)：KFS171
產(chǎn)品規(guī)格：2×50μg

Fluo-2 zuì早是由Roger Tsien 博士發(fā)明的鈣離子指示劑Fluo 系列之一，目前，F(xiàn)luo-3 和Fluo-4 已成熟商品化。然而，F(xiàn)luo-2 在細(xì)胞內(nèi)比Fluo-4 要更明亮，主要可能是由于大部分細(xì)胞對Fluo-2 的加載能力要高于Fluo-4。

Fluo-3 成像涉及到鈣離子信號(hào)通路的多個(gè)方面，F(xiàn)luo-3 經(jīng)常應(yīng)用在流式細(xì)胞術(shù)上，如螯合劑光活化、第二信使、神經(jīng)遞質(zhì)以及細(xì)胞水平的藥理篩選。Fluo-3 在這些應(yīng)用里之所以能大量運(yùn)用主要是由于其幾個(gè)重要特性：Fluo-3 可以被氬離子激光器488nm 激發(fā)，并在與Ca2+結(jié)合后，發(fā)射熒光很明亮的熒光信號(hào)。Fluo-4 是Fluo-3 以兩個(gè)氟原子取代氯原子的類似物，這一微小的結(jié)構(gòu)變化使得Fluo-4探針在488nm 激發(fā)光下的熒光信號(hào)得到增強(qiáng)，信號(hào)穩(wěn)定持續(xù)，可以應(yīng)用于共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、微孔板讀數(shù)儀。

Fluo-2、Fluo-3 和Fluo-4 在與Ca2+結(jié)合后熒光增強(qiáng)，與紫外激發(fā)的探針fura-2 和indo-1 不同，不會(huì)發(fā)生光譜漂移。熒光光密度在與Ca2+結(jié)合后，增強(qiáng)至少100 倍。

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貨號(hào)	名稱	規(guī)格
BTN90605B	TdT加尾法DNA生物素標(biāo)記試劑盒	5次
BTN151203	生物素標(biāo)記UTP溶液(Biotin-16-UTP )	25μL
BTN91104A	Denhardt溶液(同位素探針)	250mL
YT031	生物素標(biāo)記DNA探針制備試劑盒(隨機(jī)引物法)	10次
YT032	化學(xué)發(fā)光法生物素標(biāo)記核酸檢測試劑盒	1000cm2
YT359	細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光探針(Fluo-3 AM)	20微升
YT360	氯離子熒光探針(MQAE)	20mg

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名稱：5′末端同位素標(biāo)記試劑盒
貨號(hào)：BTN131036
規(guī)格：20次
本產(chǎn)品為DNA 5′末端標(biāo)記系統(tǒng)，利用T4 Polynucleotide Kinase(T4多聚核苷酸激酶)和［γ-32P］ATP 對粘性末端或平末端的DNA或RNA的5′末端進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。原理如下：


產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 使用本試劑盒之前，不需要對 5′末端的磷酸基團(tuán)進(jìn)行去磷酸化處理，因?yàn)槭褂玫膋inase 能使5′末端的磷酸與[γ-32P]ATP的γ-磷酸進(jìn)行交換。
2. 合成的單鏈或雙寡核苷酸的5′末端游離的OH基團(tuán)都能通過Kinase反應(yīng)被標(biāo)記(或者只是簡單的磷酸化)。
3. 提供的兩種反應(yīng)液使交換反應(yīng)和磷酸化反應(yīng)都能進(jìn)行，均能得到大于106 cpm/pmol(5′-end)的比活性。

試劑盒組份：

成分	規(guī)格
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	20μl
5×交換反應(yīng)緩沖液	100μl
10×磷酸緩沖液	50μl
Control DNA	20μl
說明書	1份

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、交換反應(yīng)
1. 實(shí)驗(yàn)前需自備的試劑：7 M 醋酸銨、乙醇、70%乙醇等
2.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

成分	加入的體積
自備的5′磷酸化DNA片段	14μL(≤5 pmoles的5′末端)
5×交換反應(yīng)緩沖液	5μL
[γ-32P]ATP	5μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補(bǔ)足到25μL

注：5 pmoles的5′末端約等于0.17μg的長100bp的雙鏈DNA。
3. 37℃反應(yīng)30分鐘。
4. 70℃加熱5～10分鐘使酶失活。
5. 加入10μl的7 M CH3COONH4(pH4.5)。如使用CH3COONa做乙醇沉淀時(shí)使其終濃度達(dá)300mM。
6. 加入87.5μl(2.5倍)的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
7.離心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
8. 用適當(dāng) Buffer 溶解沉淀。
注：通過第5～8 步操作幾乎可以除去大部分未反應(yīng)的[γ-32P] ATP，如要完全將其除去時(shí)，乙醇沉淀后用凝膠過濾等方法精制即可。如需用苯酚抽提除去蛋白質(zhì)時(shí)，請?jiān)诘? 步之后進(jìn)行。

二、磷酸化反應(yīng)標(biāo)記

A. 去磷酸化反應(yīng)
1. 實(shí)驗(yàn)前需自備的試劑：TE 飽和酚/氯fǎng、3 M NaCl 、乙醇、70%乙醇、牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)等
2.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

成分	加入的體積
自備的DNA片段	133μL(≤10μg)
1M Tris-HCl，pH8.0	15μL
牛小腸堿性磷酸酶(CIAP，10～20U/μL)	2μl
滅菌的超純水	補(bǔ)足到150μL

3. 50℃反應(yīng)30分鐘。
4. 加入150μl的TE 飽和酚/氯fǎng/異戊醇(25：24：1)，充分混勻。
5.離心，取上層(水層)移到另一個(gè)微量離心管中。
6. 重復(fù)操作 4～5。
7. 加入7.5μl的3 M NaCl(zuì終濃度150mM)。
8. 加入375μl(2.5倍量)的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
9.離心回收沉淀，用 1mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。
10. 使用 20μl的TE Buffer 溶解沉淀。

B. 磷酸化反應(yīng)(前反應(yīng))
1.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

成分	加入的體積
自備的DNA片段	20.5μL(≤5 pmoles的5′末端)
10×磷酸緩沖液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補(bǔ)足到25μL

2. 37℃反應(yīng)30分鐘。
3.下面的操作與交換反應(yīng)的第4-8 步操作相同。

三、合成DNA 寡核苷酸的標(biāo)記
1.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

成分	加入的體積
Oligonucleotide DNA with free 5′-OH(5～10 pmoles)	≤3μL
10×磷酸緩沖液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補(bǔ)足到25μL

2. 37℃反應(yīng)30分鐘。
3.下面的操作與交換反應(yīng)的第4-8 步操作相同。

四、合成DNA 寡核苷酸的標(biāo)記
當(dāng)摻入水平很低的時(shí)候，需要使用本步驟，即通過體積排阻色譜或過濾試劑盒除去未反應(yīng)的標(biāo)記。Sephadex G-50 層析柱(需另購)對于去除未摻入的dNTPs效果很好，它還能大幅減少小于20個(gè)堿基的DNA 寡核苷酸和小于20bp的雙鏈DNA的量。使用之前需要在70℃加熱5～10分鐘以使T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 層析柱可以用來純化長度不小于10個(gè)堿基的寡核苷酸。

注意事項(xiàng)：
1.緩沖液可在室溫融解。融解后立即置于冰中，使用前充分混勻。
2. 5×交換反應(yīng)緩沖液于-20℃凍結(jié)保存時(shí)會(huì)有白色渾濁出現(xiàn)，但不影響反應(yīng)效果。
3.酶切得到的DNA片段需經(jīng)乙醇沉淀等方法純化。
4. 當(dāng)用于交換反應(yīng)的DNA在5 pmoles以上(約1,000bp以上)時(shí)，標(biāo)記效率有時(shí)會(huì)低于106 cpm/pmol。
5. 如果交換反應(yīng)所用 DNA低于500bp時(shí)，標(biāo)記效率有時(shí)會(huì)有所降低。
6. 若不進(jìn)行放射線標(biāo)記，僅使用本試劑盒做5′末端磷酸化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)體系中的［γ-32P］ATP可用5μl的10mM ATP 代替。
7. 磷酸化反應(yīng)時(shí)的［γ-32P］ATP可用［γ-35S］ATP 替代。

使用舉例：
按照使用方法中交換反應(yīng)和合成DNA 寡核苷酸的標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)操作，取λ-BstP I，λ-Hpa I，λ-EcoT22 I 各3 pmols，用［γ-32 P］ATP 通過正向磷酸化反應(yīng)或交換反應(yīng)標(biāo)記。各DNA片段的放射自顯影結(jié)果如下所示：


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