細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Ⅱ(AP)是高品質(zhì)的細(xì)胞凋亡與增殖產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品用于科研目的，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Ⅱ(AP)是我司眾多優(yōu)質(zhì)細(xì)胞凋亡與增殖之一，質(zhì)量堪比同類進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格非常優(yōu)惠，目前正熱烈促銷中，恭候您的咨詢訂購。...

特別提示：包括細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Ⅱ(AP)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Ⅱ(AP)
產(chǎn)品貨號(hào)：ZN1530
產(chǎn)品規(guī)格：20T

保存條件：-20℃冰凍保存。
保存期：一年
工作原理：
在機(jī)體內(nèi)部隨時(shí)都在發(fā)生著細(xì)胞的死亡。傳統(tǒng)上用顯微鏡來觀察細(xì)胞的死亡，其特征為核染色質(zhì)的濃縮及碎片的形成。但是這種現(xiàn)象出現(xiàn)的很晚，時(shí)間也很短暫。凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細(xì)胞自身的染色質(zhì)或DNA 被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與DNA斷點(diǎn)數(shù)目相同的3’-OH 末端。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以將dì高辛標(biāo)記的dUTP(DIG-dUTP)標(biāo)記至3’-OH 末端，DIG-dUTP 結(jié)合在DNA斷點(diǎn)部位，可以通過生物素化抗dì高辛抗體(Anti-DIG-Biotin)和 SABC-AP反應(yīng)后，加入顯色底物 BCIP/NBT予以顯示。凋亡的細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細(xì)胞。
試劑盒內(nèi)容：
1.標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer)1ml
2.末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT,×20)20μl
3.DIG-dUTP(×20)20μl
4.封閉液(Blocking Reagent)4ml
5.生物素化抗dì高辛抗體(×100)20μl
6..SABC-AP(×100)20μl
7.Proteinase K(×200)50μl
8.BCIP/NBT 顯色劑(×20)0.2ml
9.抗體稀釋液4ml
陽性對(duì)照片2張
用戶自備試劑：
1.多聚賴氨酸或APES。
2.0．01M TBS(pH7.5)(配法:1L 雙蒸餾水中加入8.5克氯化鈉,1.2 克Tris和0.45—0.5ml純乙酸)。
3.0.01M TBS(pH9.0--9.5)(配法:1L 雙蒸餾水中加入 8.5克氯化鈉,1.2克Tris)。
4.核固紅—復(fù)染用。
5.水溶性封片劑。
操作步驟：
1.樣品處理
(1)玻片預(yù)先用多聚賴氨酸或APES進(jìn)行處理。
(2)細(xì)胞涂片和冰凍切片：zuì重要的是及時(shí)固定。用 4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0---7.6)室溫下固定 30—60分鐘。PBS洗2分鐘×2次。蒸餾水洗滌 2分鐘×2次。
(3)組織：應(yīng)及時(shí)固定。常規(guī) 4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0---7.6)或10%中性緩沖福爾馬林固定 4 小時(shí)以上，石蠟包埋。切片常規(guī)脫蠟入水(脫蠟務(wù)必干凈)。
2.標(biāo)本片加 0．01M TBS(pH7.5)1：200 新鮮稀釋 Proteinase K 37℃消化 1—15分鐘,TBS洗2分鐘×3次。(細(xì)胞涂片和冰凍切片一般不消化或僅消化 10—60 秒鐘。新鮮石蠟切片消化 5-10分鐘。陳舊石蠟切片消化 10-15分鐘)。
3.標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer),20μl/片,以保持切片濕潤(rùn)。然后按每張切片取 TdT和 DIG-d-UTP 各1μl，加入18μl標(biāo)記緩沖液中，混勻，甩去切片上多余液體后加混合的標(biāo)記液，20μl/片。置樣品于濕盒中，37℃標(biāo)記2 小時(shí)。
4.0．01M TBS(pH7.5)洗2分鐘×3次。
5.加封閉液 50μl/片，室溫 30分鐘，甩掉封閉液，不洗。
6.用抗體稀釋液 1：100 稀釋生物素化抗dì高辛抗體：(取1ml抗體稀釋液加生物素化抗dì高辛抗體 10μl)，混勻后 50μl/片加至標(biāo)本片上。置樣品于濕盒中，37℃反應(yīng) 30-60分鐘。0.01M TBS(pH7.5)洗2分鐘×3次。
7.用抗體稀釋液 1：100 稀釋 SABC-AP：取1ml抗體稀釋液加 SABC-AP 10μl，混勻后50μl/片加至切片。37℃反應(yīng) 60分鐘。0.01M TBS(pH7.5)洗5分鐘×4次。
8.BCIP/NBT 顯色：BCIP/NBT(×20)按 1：20的比例用 0.01M TBS(pH9.0-9.5)稀釋，混勻。顯色液加至標(biāo)本上。避光顯色 20-30分鐘，若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。充分水洗。
9.必要時(shí)可用核固紅等復(fù)染。水溶性封片劑封片，也可簡(jiǎn)單地用甘油封片。
鏡檢。
結(jié)果判定：
細(xì)胞核中有紫藍(lán)色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡的細(xì)胞。
注意事項(xiàng)：
1.試劑盒嚴(yán)格-20℃存放。
2.初用時(shí)如試管底部無可見的試劑，在離心機(jī)離心 3分鐘，使試劑沉至管底。
3.檢測(cè)過程中切勿使樣品干涸。
4.BCIP/NBT 顯色較慢，可適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間。

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名稱：Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒
貨號(hào)：YT133
規(guī)格：20次|50次
本試劑盒是用EGFP標(biāo)記的重組人Annexin V來檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面的磷酯酰絲氨酸的一種細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。一個(gè)包裝的本試劑盒共可以檢測(cè)20個(gè)樣品。可以使用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

試劑盒組份：
Annexin V-EGFP—————————100μl
Annexin V-EGFP結(jié)合液——————12ml
碘化丙啶染色液—————————220μl

Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。但僅Annexin V被報(bào)道可以調(diào)控一些PKC的活性。

Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡(jiǎn)稱PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會(huì)把磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷酯酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會(huì)促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。

用帶有綠色熒光的熒光探針EGFP標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-EGFP，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常簡(jiǎn)單而直接地檢測(cè)到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。

本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對(duì)于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-EGFP可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。

綜上所述，用Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色后，正常的活細(xì)胞不被Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色；凋亡早期的細(xì)胞僅被Annexin V-EGFP染色，碘化丙啶染色呈陰性；壞死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞可以同時(shí)被Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色。

注意事項(xiàng)：
1. 如果有細(xì)菌或真菌污染，會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)效果。
2. 染色后宜盡快檢測(cè)，時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
3. 如果細(xì)胞收集過程中使用了胰酶，需注意設(shè)法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會(huì)消化并降解Annexin V-EGFP，zuì終導(dǎo)致染色失敗。
4. 熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時(shí)，盡量縮短觀察時(shí)間，同時(shí)在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。

儲(chǔ)存條件：4℃避光，有效期6個(gè)月。

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