北京百奧萊博供應的絲狀真菌線粒體DNA提取試劑盒用于科學研究，我公司的絲狀真菌線粒體DNA提取試劑盒品質上佳，經過多年的開發生產，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括絲狀真菌線粒體DNA提取試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：絲狀真菌線粒體DNA提取試劑盒
英文名稱：Filamentous fungal mitochondria DNA extraction kit
產品貨號：BTN130831
產品規格：15次

線粒體是重要的、負責能量產生的其重要的細胞器。對絲狀真菌線粒體進行生化，遺傳和分子生物學研究都需要行線粒體純化。本產品就是基于密度梯度離心的，專門用于從絲狀真菌葉片中純化完整線粒體、再從中純化線粒體DNA的試劑盒。

試劑盒特點：
1. 即用型試劑盒，用戶不需要單獨配制各種溶液。
2. 所得線粒體可用于后續的SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白組分析、線粒體DNA和線粒體RNA純化。
3. 本產品足夠15次線粒體純化和15次線粒體DNA提取，每次可處理10-20g菌絲體，能得到1-5mg左右線粒體。
4. 已經成功用于Aspergillus candidus、Aspergillus nidμLans、Magnaporthe oryzae、Neurospora crassa、Penicillium chrysogenum、Rhizopus stononifer等絲狀真菌。

試劑盒組成：

成分	規格
溶液A	250mL×2
成分B	150g
溶液C	120ml
帶柄尼龍濾膜	1個
通用線粒體DNA溶液A	10ml
通用線粒體DNA溶液B	5ml
通用線粒體DNA溶液C	15ml
說明書	1份

儲存條件：常溫運輸和保存，保存期限一年。

使用方法：
注意：純化DNA提取用的線粒體的要求比純化功能研究用的線粒體的要求要低，但整個操作還是zuì好在冰上或者在冷室進行，所用器皿和溶液zuì好在4℃預冷，離心zuì好要在4℃進行，離心力以g而不是rpm計算。

一：菌絲的搖瓶培養
1. 使用合適的絲狀真菌培養基，接種孢子至終濃度為2×10E6/mL。一般100mL液體培養基可以得到0.8-1.2g菌絲體，而本方法一次可以處理10-20g菌絲體，故zuì好一次培養1-2升。
2.在合適的溫度(如25℃、30℃或37℃，根據真菌不同而不同)250rpm/min搖晃培養16-20小時。
3. 用多層紗布或多層過濾紙過濾收集菌絲，用冰浴的自備去離子水洗滌菌絲三次去除殘留的培養基。
4. 用吸水紙吸干菌絲的水分，稱重后立即使用。如果在-80℃或液氮長期放置，線粒體回收效率將減低。

二：線粒體粗提液的制備
5. 制備溶液A工作液：每次提取需150mL溶液A工作液，制備方法是將20mL溶液A和130mL自備去離子水混合，冰上預冷即可。
6.在200mL燒杯中，加入100mL預冷的溶液A工作液，再加入新制備的菌絲體，然后全部轉移到Waring勻漿機(家用果汁勻漿機)中，低速勻漿10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把菌絲按入勻漿機底部后，再低速勻漿10秒。注意：還可以選擇Dounce玻璃勻漿器，Polytron勻漿機和研磨(加玻璃珠)等方法，但它們單次處理量一般都較小，需多份處理再匯集。
7. 用帶柄尼龍濾膜過濾勻漿液，用預冷的200mL量筒收集穿透液。
8. 將剩下的菌絲體轉移到Waring勻漿機中，再加入40mL預冷的溶液A工作液，低速勻漿10秒，用上步的帶柄尼龍濾膜過濾，用預冷的200mL量筒收集穿透液。注意：帶柄尼龍濾膜后可反復使用。
9. 將穿透液分到4個預冷的50mL的塑料離心管中(每個約35mL)。
10.在水平轉子離心機上4℃ 4000g離心10分鐘，小心轉移上清(含線粒體的部分)到4個新的離心管中。沉淀含細胞核和未裂解的細胞，可以棄之不用。如果要用于純化細胞核DNA，則可以放-80℃長期保留。
11. 將含上清液的4個離心管在4℃ 10000g離心20分鐘。
12. 每個離心管中加2.5mL預冷的溶液A工作液重懸線粒體沉淀并匯集(共約10mL)，此為線粒體粗提液。
13. 如果直接用線粒體粗提液提取線粒體DNA，容易有細胞核DNA污染。
 具體步驟是：在水平轉子離心機上4℃ 10000g離心7分鐘，小心棄上清，沉淀為線粒體，直接用于第三步的線粒體DNA提取。
14. 如果需要高純度、無污染的線粒體DNA，則需要用密度梯度離心法將完整的線粒體和其他細胞碎片進一步分離。具體見下步線粒體精提液的制備。

三：線粒體精提液的制備(密度梯度離心法)
15. 制備重液和輕液：將4.1克成分B干粉加到6.3mL溶液C中，充分搖晃混勻得10mL重液。將4.1克成分B干粉加到6.3mL去離子水中，充分搖晃混勻得10mL輕液。
16.在50mL塑料離心管中先加入10mL重液，再在其上輕輕加上10mL輕液，zuì后加上第11步所得的約10mL線粒體粗提液。
17. 加平衡離心管后在水平轉子冷凍超速離心機上4℃ 43000g離心2小時，重液和輕液間的帶為完整線粒體。
18. 用廣口吸管小心將線粒體轉移到新的離心管中，加入等倍體積的預冷的溶液C，輕柔混勻。取少量在相差顯微鏡下檢查線粒體完整性。
19.在水平轉子離心機上4℃ 19000 g離心20分鐘，小心將上清吸出后，線粒體沉淀可以直接用于DNA提取。

四：線粒體DNA提取
20. 將600μL通用線粒體DNA提取試劑盒溶液A加入到上步得到的線粒體沉淀中并吹打混勻，然后轉移到1.5mL離心管中。
21. 65℃放置5分鐘。
22. 加入300μL通用線粒體DNA提取試劑盒溶液B，震蕩混勻10-30秒。
 注意：溶液B非常粘稠，可以將其預熱到65℃并剪掉一截槍頭后再取。
23. 加入200μL自備的lǜ仿，震蕩混勻10-30秒。
24. 12000g室溫離心3分鐘。此時上清液將變得透明，中間層有白膜。
25.小心轉移上清液(約0.8mL)到一個新的1.5mL離心管中，避免觸及中間層的白膜，可留少量上清不取。
26. 加入1倍體積的通用線粒體DNA提取試劑盒溶液C，顛倒30次混勻。
27. 12000g室溫離心5分鐘，小心棄上清液。
28.在離心管中加入1mL自備的75%乙醇，震蕩30秒。
29. 12000g室溫離心1分鐘，小心棄上清液。
30. 12000g室溫離心半分鐘，殘留液體將匯集在管底。
31. 用洗液槍吸棄管底殘留液(約50μL)。
32. 加50-100μL自備的TE緩沖液，溶解DNA沉淀即得線粒體DNA溶液。直接取5-10μL電泳檢測，其余放直接使用或放-80℃冰箱備用。

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