血液線粒體DNA提取試劑盒的品牌是百奧萊博，是優質的DNA提取純化產品，本制品用于生化實驗研究等領域，本品質量穩定，價位合理，需要血液線粒體DNA提取試劑盒等DNA提取純化產品的客戶，請到我公司官網聯系我們。...

特別提示：包括血液線粒體DNA提取試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：血液線粒體DNA提取試劑盒
英文名稱：Blood Mitochondrial DNA Extraction Kit
產品貨號：XH007
產品規格：50T|100T

本試劑盒可用于從人或者哺乳動物外周血中分離出完整而純化的線粒體DNA。線粒體DNA提取的關鍵是盡可能的去掉核DNA。本試劑盒利用差速離心得到比較純凈的線粒體，再利用DNA酶消化和裂解緩沖系統等多步驟去掉核DNA，zuì后得到純凈的線粒體DNA。可用于PCR等對純度要求較高的實驗。

試劑盒組成：

組份	50T	100T	保存溫度
DNase I	12mg	22mg	-20℃溶解后分裝
RNase A	0.5ml	1ml	-20℃保存經常 使用可2～8℃放置
紅細胞裂解液（10X）	100ml	100ml*2	2～8℃
細胞裂解液	50mL	100 mL	2～8℃
線粒體清洗液	25 mL	50mL	2～8℃
DNA酶反應液	6ml	12ml	2～8℃
線粒體裂解液	10ml	20ml	常溫放置，如有 沉淀可37℃水浴
蛋白沉淀液	7.5ml	15ml	2～8℃
核酸助沉劑	0.5ml	1ml	2～8℃
TE緩沖液	25ml	50ml	2～8℃

保存條件：2～8℃可保存一年，DNASE I和RNase A -20℃保存。使用前，在DNASE I中加入600μl（50T）或者1200μl（100T）的DNA酶反應液，分裝后-20℃保存三個月，如果超過三個月，活性可能會降低，請自行訂購DNASE I。線粒體裂解液使用前常溫保存，如有沉淀可37℃水浴溶解，不影響使用。

操作步驟：
準備工作：在DNASE I中加入600μl（50T）或者1100μl（100T）的DNA酶反應液，適當分裝后-20℃保存。紅細胞裂解液（10X）用雙蒸水稀釋10倍成工作液。線粒體裂解液保存于常溫，如有沉淀37℃水浴溶解，離心機溫度下降到4℃（2～8℃），如無低溫離心機，也可以常溫離心，并將離心時間為10min的改為5min，但zuì后所得DNA品質及產量可能會有一定影響。

1．血液處理：
  血液要求：EDTA抗凝外周血，zuì好使用新鮮血液。對于陳舊血液，由于凍凝過程中冰晶已經對細胞核膜和線粒體膜產生損傷，所以線粒體DNA得率會大大減少。
  取外周血約3-5ml（適當分成幾管），加入3倍體積的紅細胞裂解液（稀釋后的工作液），混勻，800×g 5min離心收集白細胞。加入1-2紅細胞裂解液（稀釋后的工作液），吹打重懸白細胞，合并于一管中，800×g 5~10min離心收集白細胞。此時如果白細胞有可見紅色，可再次用少量紅細胞裂解液洗細一次。
2．在收集到的白細胞中，加入1.0 mL冰預冷的細胞裂解液重懸細胞，將細胞懸液轉移到小容量玻璃勻漿器內，0℃冰浴研磨20~40次；
3．勻漿物轉移到離心管，4℃，1000×g離心5min；
4．取上清，加入一新的離心管中，4℃，1000×g再次離心5min（一共兩次離心，完整去核）。
5．取上清，加入一新的離心管中，4℃，12,000×g離心10min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉移到新離心管，線粒體沉淀在管底；
6．在線粒體沉淀中加入0.5 mL線粒體清洗液重懸線粒體沉淀，4℃，1000×g離心5min；
7．取上清，加入一新的離心管中，4℃，12,000×g離心10min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底；
8．加入100μl DNA酶反應液重懸線粒體，吹打均勻后，再加入10μl DNASE I溶液（見準備工作），混勻，37℃水浴10min。此步為消化線粒體表面吸付的核DNA。4℃，12,000×g離心5min。盡可能的棄上清，再加入200μl TE重懸線粒體沉淀，4℃，12,000×g離心5min，洗去殘留的DNA酶。
9．得到的沉淀，用200μl TE緩沖液重懸線粒體沉淀，加入10μl RNase A。加入200μl線粒體裂解液，輕輕混勻（不可吹打），放置1～2min，再加入150μl蛋白沉淀液，迅速混勻。4℃，12,000×g離心5min。此步驟可進一步去除核DNA。
10．取上清，加入一新的離心管中（如用于酶切分析，可加入此步：選用等體積的酚氯fǎng異戊醇25:24:1抽提一次，再用氯fǎng抽提一次，或者直接用氯fǎng抽提兩次，一般來說，此步可去掉一些微量蛋白及糖類，但會造成線粒體DNA的損失，因而用于PCR時可省，并不影響后續實驗），加入0.6倍體積的異丙醇（如無異丙醇，可加入2.5倍體積的乙醇沉淀DNA，如離心管太滿可分兩管）及5-10μl核酸核酸助沉劑，混勻，-20℃沉淀半小時左右（此步可省），4℃，12,000×g離心10min。
11．棄上清，再加入1ml 70%乙醇清洗，4℃，12,000×g離心5min。重復用70%乙醇洗一次。
12．棄上清，再次離心1min吸棄上清，不要碰到管底，開蓋涼干約5-10min。
13．加入10～20μl TE緩沖液,輕彈管底，37℃水浴5分鐘，線粒體DNA溶解。
14．進行DNA檢測及-20℃保存，進行下步的實驗。

注意事項：
1．為保證獲得完整及盡可能多的線粒體，勻漿條件要示：是全程低溫操作。第二是快速。第三，如有條件可將勻漿后的碎片在顯微鏡下觀察。
2．線粒體DNA本身含量很低，如果電泳檢測不到，可加大上樣量，用更少量的TE溶解沉淀，或者直接進入PCR檢測。
3．以離心力g計算正確的離心速度，不同的離心機可據此計算離心速度。

一般低溫度心機都有離心力顯示，如果沒有，可以用以下公式簡單的換算。
  G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]²
G為離心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍數來表示；[rpm]²即：轉速的平方；R為半徑，單位為厘米。

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