北京百奧萊博供應的敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅳ用于科學研究，本產品質量好，且具價格，深為用戶稱道，了解更多敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅳ等探針標記及檢測產品請聯系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅳ(CY3)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅳ(CY3)
產品貨號：ZN1522
產品規格：100T

保存：置4℃。
工作量：100 張切片。
有效期：一年。
所謂原位雜交是指借助于核酸分子雜交的方法，在顯微鏡水平檢測和定位特異的核苷酸片段。現在原位雜交已成為在分子水平研究腫瘤和遺傳性疾病的發生，發展和調控等根本性問題的有力工具，其作用是免疫組化所無法代替的。 具有敏感性特高，操作簡便和結果準確的優點。該試劑盒用于 mRNA的雜交，不推薦使用每個探針分子僅標記一個地高xīn的寡核苷酸探針。
如果使用 cDNA 探針，應在雜交之前變性探針。
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2．預雜交液 2ml；
3.寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml;
5.生物素化鼠抗地高xīn 5ml;
6．SABC-CY3 100ul(1:100)
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,0.5M PBS)
一．培養細胞和冰凍切片
準備工作：緩沖液的配備
3%檸檬酸——100ml 蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7·H2O)3g,pH2.0左右。
2×SSC——1000ml 蒸餾水中加氯化鈉 17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3·2H2O，分子量 294)8.8g。
0.5×SSC——300ml 蒸餾水加 100ml 2×SSC 即可。
0.2×SSC——270ml 蒸餾水加 30ml 2×SSC 即可。
20%甘油——20ml 甘油加 80ml 蒸餾水即可。
0.5 M PBS——1000ml 蒸餾水加氯化鈉 30g,Na2HPO4·12H2O 6g,NaH2PO4·2H2O 0.4g,PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時固定，并在固定液中加入 0.1%的DEPC 處理，以抑制 RNA酶對 mRNA的分解作用.
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度 10-20μM。
2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養，條件為37℃和 5%的CO2，所用培養基為Dulbecco基礎培養基。細胞長好后 0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS，含有 1/1000 DEPC。
室溫固 定 20--30分鐘。蒸餾水洗，干燥后可-20℃冰凍保存 2 周。
4．暴露 mRNA 核酸片段：切片上滴加 3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加 2 滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化 5—120 秒鐘。有時也可以不消化。0.5M PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
5．預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加 20%甘油 20ml 以保持濕度。按每張切片 20μl加預雜交液。恒溫箱 37-40℃2—4 小時。吸取多余液體，不洗。
6．雜交——用雜交液稀釋地高xīn標記的寡核苷酸探針，濃度一般 0.5-2μg/ml。按每張切片加20μ ι 雜交液。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱 37—40℃雜交過夜。
7．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，30—37℃左右水溫的2×SSC洗滌 5分鐘×2次；0.5×SSC洗滌15分鐘×1次；0.2×SSC洗滌 15分鐘×1次。必要時可重復 0.2×SSC洗滌 1次。
8.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
9.滴加生物素化鼠抗地高xīn：37℃60或室溫 120分鐘。0.5M PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
10．滴加 SABC-cy3：取 1ul SABC–FITC 加原位雜交用 PBS 100ul,每張切片加 50ul 37℃ 30分鐘。0.5M PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
11．用水溶性封片劑或抗熒光衰減封片劑 封片后，熒光顯微鏡觀察。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 MPBS，含有 1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過 4mm的小塊，固定 1 小時即可，較大的標本固定不要超過 2小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一定不要超過 1 小時。
1．常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片常規脫蠟至水。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加 2 滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化 3--30分鐘(視標本厚薄、新舊自行調整)。充分的消化可以使mRNA得到暴露，從而增強雜交信號；但另一方面，過度的消化又使切片明顯減薄乃至消失，從而失去雜交信號。由于用戶的切片情況各不相同，這就需要用戶比較不同的消化時間，例如 10分鐘，20分鐘，30分鐘，以找到zuì佳的消化時間。0.5M PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
其余步驟和冰凍切片5-11步相同。
結果觀察：
陽性細胞的胞漿著色呈黃綠色熒光。
注意事項：
如果有少量的細胞核著色屬于正常情況；如果出現大量的細胞核著色，往往和標本固定時間過長有關，應重新處理標本。有其它明顯的非特異性染色現象時，可以用預雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2—5倍。

根據您的關注的敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅳ(CY3)，您可能還對以下產品有需求：



名稱：5′末端同位素標記試劑盒
貨號：BTN131036
規格：20次
本產品為DNA 5′末端標記系統，利用T4 Polynucleotide Kinase(T4多聚核苷酸激酶)和［γ-32P］ATP 對粘性末端或平末端的DNA或RNA的5′末端進行標記反應。原理如下：


產品特點：
1. 使用本試劑盒之前，不需要對 5′末端的磷酸基團進行去磷酸化處理，因為使用的kinase 能使5′末端的磷酸與[γ-32P]ATP的γ-磷酸進行交換。
2. 合成的單鏈或雙寡核苷酸的5′末端游離的OH基團都能通過Kinase反應被標記(或者只是簡單的磷酸化)。
3. 提供的兩種反應液使交換反應和磷酸化反應都能進行，均能得到大于106 cpm/pmol(5′-end)的比活性。

試劑盒組份：

成分	規格
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	20μl
5×交換反應緩沖液	100μl
10×磷酸緩沖液	50μl
Control DNA	20μl
說明書	1份

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、交換反應
1. 實驗前需自備的試劑：7 M 醋酸銨、乙醇、70%乙醇等
2.在微量離心管中制備下列反應液：

成分	加入的體積
自備的5′磷酸化DNA片段	14μL(≤5 pmoles的5′末端)
5×交換反應緩沖液	5μL
[γ-32P]ATP	5μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補足到25μL

注：5 pmoles的5′末端約等于0.17μg的長100bp的雙鏈DNA。
3. 37℃反應30分鐘。
4. 70℃加熱5～10分鐘使酶失活。
5. 加入10μl的7 M CH3COONH4(pH4.5)。如使用CH3COONa做乙醇沉淀時使其終濃度達300mM。
6. 加入87.5μl(2.5倍)的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
7.離心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
8. 用適當 Buffer 溶解沉淀。
注：通過第5～8 步操作幾乎可以除去大部分未反應的[γ-32P] ATP，如要完全將其除去時，乙醇沉淀后用凝膠過濾等方法精制即可。如需用苯酚抽提除去蛋白質時，請在第8 步之后進行。

二、磷酸化反應標記

A. 去磷酸化反應
1. 實驗前需自備的試劑：TE 飽和酚/氯fǎng、3 M NaCl 、乙醇、70%乙醇、牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)等
2.在微量離心管中制備下列反應液：

成分	加入的體積
自備的DNA片段	133μL(≤10μg)
1M Tris-HCl，pH8.0	15μL
牛小腸堿性磷酸酶(CIAP，10～20U/μL)	2μl
滅菌的超純水	補足到150μL

3. 50℃反應30分鐘。
4. 加入150μl的TE 飽和酚/氯fǎng/異戊醇(25：24：1)，充分混勻。
5.離心，取上層(水層)移到另一個微量離心管中。
6. 重復操作 4～5。
7. 加入7.5μl的3 M NaCl(zuì終濃度150mM)。
8. 加入375μl(2.5倍量)的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
9.離心回收沉淀，用 1mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。
10. 使用 20μl的TE Buffer 溶解沉淀。

B. 磷酸化反應(前反應)
1.在微量離心管中制備下列反應液：

成分	加入的體積
自備的DNA片段	20.5μL(≤5 pmoles的5′末端)
10×磷酸緩沖液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補足到25μL

2. 37℃反應30分鐘。
3.下面的操作與交換反應的第4-8 步操作相同。

三、合成DNA 寡核苷酸的標記
1.在微量離心管中制備下列反應液：

成分	加入的體積
Oligonucleotide DNA with free 5′-OH(5～10 pmoles)	≤3μL
10×磷酸緩沖液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補足到25μL

2. 37℃反應30分鐘。
3.下面的操作與交換反應的第4-8 步操作相同。

四、合成DNA 寡核苷酸的標記
當摻入水平很低的時候，需要使用本步驟，即通過體積排阻色譜或過濾試劑盒除去未反應的標記。Sephadex G-50 層析柱(需另購)對于去除未摻入的dNTPs效果很好，它還能大幅減少小于20個堿基的DNA 寡核苷酸和小于20bp的雙鏈DNA的量。使用之前需要在70℃加熱5～10分鐘以使T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 層析柱可以用來純化長度不小于10個堿基的寡核苷酸。

注意事項：
1.緩沖液可在室溫融解。融解后立即置于冰中，使用前充分混勻。
2. 5×交換反應緩沖液于-20℃凍結保存時會有白色渾濁出現，但不影響反應效果。
3.酶切得到的DNA片段需經乙醇沉淀等方法純化。
4. 當用于交換反應的DNA在5 pmoles以上(約1,000bp以上)時，標記效率有時會低于106 cpm/pmol。
5. 如果交換反應所用 DNA低于500bp時，標記效率有時會有所降低。
6. 若不進行放射線標記，僅使用本試劑盒做5′末端磷酸化反應時，反應體系中的［γ-32P］ATP可用5μl的10mM ATP 代替。
7. 磷酸化反應時的［γ-32P］ATP可用［γ-35S］ATP 替代。

使用舉例：
按照使用方法中交換反應和合成DNA 寡核苷酸的標記的實驗操作，取λ-BstP I，λ-Hpa I，λ-EcoT22 I 各3 pmols，用［γ-32 P］ATP 通過正向磷酸化反應或交換反應標記。各DNA片段的放射自顯影結果如下所示：


關注敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅳ(CY3)，的同時，為您推薦更多您可能感興趣的產品：


BTN90603B 隨機引物法DNA探針生物素標記試劑盒 5次
BTN121110 超快DNA-RNA兩用轉膜試劑盒 5次
BTN130907 脫脂奶粉 50g
BTN130904 超級雜交液(Oligo探針) 10mL
BTN130908 鯡魚精DNA溶液 1mL
BTN70904A 酵母tRNA溶液(粗提) 1.5mL
BTN70904B 酵母tRNA溶液(精提) 1.5mL
BTN131165 核酸液相雜交液 10mL

如果您覺得“ZN1522 敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅳ”描述資料不夠齊全，請聯系我們獲取詳細資料。(聯系時請告訴我從給覽網看到的，我們將給您最大優惠！)
本頁鏈接：http://lgsztm.com/com_bjbiolab/sell/itemid-8564718.html
已經有949位訪客查看了本頁.