冰凍切片活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光探針DHE進行活性氧檢測的試劑盒。DHE是一種細胞膜通透性的熒光探針，被活性氧特異性氧化生成紅色熒光物質，紅色熒光強度與活性氧水平成正比，檢測紅色熒光就可知組織內活性氧的水平。...

組織切片活性氧檢測試劑盒(DHE探針)

 

產品編號：HR9069

產品組成：

儲存條件：

探針-20℃避光保存；清洗液2-8℃保存。有效期6個月。

【注】：

● 染料長期不用可以-20℃保存。避免反復凍融。

● 染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴。吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

● 試劑拆封后請盡快使用完！

組織切片活性氧檢測試劑盒(DHE探針)產品簡介：

活性氧(ROS)包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產物過氧化物和羥化物等，參與細胞生長增殖、發育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。

冰凍切片活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光探針DHE進行活性氧檢測的試劑盒。DHE是一種細胞膜通透性的熒光探針，被活性氧特異性氧化生成紅色熒光物質，紅色熒光強度與活性氧水平成正比，檢測紅色熒光就可知組織內活性氧的水平。

在激發波長535nm，發射波長610nm附近，使用熒光顯微鏡/激光共聚焦檢測紅色熒光，從而測定樣本內活性氧水平。利用本試劑盒可以快速定性檢測樣本內活性氧水平變化差異。

切片樣本的活性氧檢測一般最好使用振動切片或者新鮮的冰凍切片樣本。石蠟切片樣本的ROS在切片的的制作過程中會損失掉，有條件的話就使用振動切片或者冰凍切片樣本，一般不建議使用石蠟切片樣本。已經制備好的石蠟切片樣本中殘余的ROS也可以用本試劑盒檢測。

產品特點：

● 使用方便：可用熒光顯微鏡直接拍照；

● 背景低，靈敏度高；

● 線性范圍寬，使用方便。

檢測方法：

● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦顯微鏡

樣本類型：

● 新鮮冰凍切片 ● 振動切片

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 熒光顯微鏡/激光共聚焦顯微鏡激發波長535nm，發射波長610nm。

● PBS/HBSS(無酚紅)

使用注意事項：

● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 盡量縮短探針標記后到測定所用的時間，以減少各種可能的誤差。

● 對于某些樣本，如果熒光太強，可以按照1:200-1:2000稀釋探針。探針標記的時間也可以根據情況在20-60分鐘內適當進行調整。

● 冰凍切片制作不需要經過固定脫水包埋等步驟，直接冷凍后切片貼片。

● 有條件也可采用振動切片的方法。有些方便處理的樣品類型也可采用徒手切片。

● 以下操作步驟僅供參考，請根據實際樣本情況調整。

組織切片活性氧檢測試劑盒(DHE探針)使用方法：

一、 試劑配制

1、根據樣本數，用純水將DHE探針200-2000倍稀釋，配成染色工作液。

【注】：

● 不可以一次性將探針全部稀釋。現配現用。

● 不同樣本的ROS差異較大，需要根據預實驗結果調整探針用量。一般染色終濃度按試劑盒中探針母液的200-2000倍稀釋，500倍稀釋適合大多數樣本。

● 如果熒光強度太強，可以增加稀釋倍數。最大可以稀釋至5000倍。

● DHE探針液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

● 微量操作時，注意探針要有效加入勻漿液，避免沒有加入。

● 以下步驟使用的DHE探針為此步驟稀釋過的探針工作液。

2、用純水將10×清洗液10倍稀釋，配成1×清洗液工作液。

二、 探針標記

1、準備待測的厚為10-20μm的未經固定處理的冰凍切片。

【注】：

● 必須使用新鮮組織(手術切除后1小時內)制成的冰凍切片/振動切片。

● 否則不新鮮的樣本可能ROS已經流失，檢測不到活性氧。

● 非新鮮樣本殘余的ROS也可以檢測到。

2、室溫下，小心加上200μL清洗液工作液，鋪滿整個切片表面，靜置3-5分鐘。

3、小心吸除清洗液。

4、滴加100-200μL染色工作液，在37℃培養箱避光孵育20-60分鐘。

【注】：

● 最好在濕盒中孵育，避免液體蒸發。

5、移除染色液。

6、用PBS洗滌切片2-3次。

7、加蓋玻片或甘油封片。

8、激光共聚焦/熒光顯微鏡檢測。

【注】：

● 染色完成后，立即進行熒光定性分析。

● 激發波長535 nm，發射波長610 nm。

● 熒光強，表明活性氧(ROS)含量高。

● 拍照后，用相應的圖像分析軟件進行光密度分析。可以用實驗中對照樣本的熒光強度值為基準，待測組樣本的熒光強度值占對照樣本的百分比來比較活性氧(ROS)程度差異。

常見問題分析：

● 活性氧結果如何分析？

ROS是多種物質的統稱，不像某一單一活性氧指標，無法檢測其絕對的含量，只能通過設置參照樣本，以參照樣本的倍數來反映目標樣本相對含量變化，這個“相對”是針對參照的。分析結果是定性的，也是沒有單位的，因為它本質上是一個比值(目標/參照)。反映的是模型樣本通過具體的干預措施(如養分缺失、缺氧、藥物治療或遺傳基因操控等)如何影響其ROS的變化，測定其ROS是增加或者降低了。

● 熒光照片如何分析？

需要有相關的熒光強度分析軟件。ROS 表達水平直接通過熒光信號的強弱和分布范圍來體現。

有的顯微鏡掃描下來的圖像本身就可以測面積和強度，可以同時測不同顏色的熒光強度。有的顯微鏡不支持此功能，可以將熒光染色彩色圖像轉換為黑白的灰度圖，然后再以灰度值作為測量指標進行分析。

要結合明場的照片具體分析。如果細胞分布均勻可以算固定面積熒光強度。成像時中心和四周有差異時，一般將四周剪切掉也可以。如果細胞分布不勻，需要找到細胞分布勻稱的視野，一個視野一個視野找。

如果要用圖片做結果，就要平行做多個圖片，作分析，統計，每張都要求熒光分布盡量一致。

為了去除雜光的影響，可以適當調節統計熒光的強度范圍，將信號過弱的背景雜光去除掉。對照組和實驗組整張圖片需要做同樣的處理，保證所有參數均要一致。

對于不同情況熒光強度的統計方法，根據實驗需要或參考文獻。可以算等面積的平均強度；也可以算閾值高于一定值的平均強度；也可以算熒光的累積而不算平均。

要根據課題需要選擇合適的測量統計方法。

● 熒光照片效果不好？

熒光拍照存在很多變量，每一個變量都會嚴重影響拍照效果。

熒光拍攝條件：拍攝環境、顯微鏡品牌和激發熒光決定了鏡下觀察的效果。同樣的操作方法和切片，在不同品牌顯微鏡下顯示出完全不同的熒光強度。

熒光衰減：熒光物質的衰減通常都是非常明顯的。同樣的一組切片，1小時內拍攝和8小時后拍攝，熒光效果完全不同。

最好用激光共聚焦顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多，通常同一張片子激光共聚焦的效果明顯更優。

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