北京百奧萊博供應的DNA片段化/末端修復/加dA尾用于科研試驗，本產品質量好，且具價格，深為用戶稱道，了解更多DNA片段化/末端修復/加dA尾等基因結構和功能產品請聯系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括DNA片段化/末端修復/加dA尾試劑（Illumina)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：DNA片段化/末端修復/加dA尾試劑（Illumina)
英文名稱：Fragmentation/End repair/dA-tailing Reagent（Illumina)
產品貨號：WH0208
產品規格：24次|96次

本制品是專門針對于illumina高通量測序平臺所優化的預混酶模塊，包含了DNA片段化、末端修復以及3"端dA尾添加所需的所有酶類，可將雙鏈DNA片段化為小片段，并分別在片段化DNA兩端添加5"-P和3"端dA，所得產物無需純化，可直接通過Fast Ligation Reagent（WH0201-01/02）用于adapter的連接。該模塊采用一步法的反應流程，省去了多步純化步驟，可對微量DNA樣本進行、快速的片段化、末端修復及dA尾添加，操作更加簡便，文庫轉化效率更高。

適用范圍：用于雙鏈DNA的片段化、末端修復及3"端添加dA，適用于illumina高通量測序平臺DNA文庫構建。
適用樣本量：1ng~1μg DNA。

產品特點：
·單管酶促反應，一步完成雙鏈DNA的片段化、末端修復、dA添加反應。
·高文庫轉化效率，DNA樣本起始量可低至1ng。

產品組成：

組分	24次	96次
5×FEA Enzyme Mix	240μl	960 μl
10×FEA Reaction Buffer	120 μl	480 μl
FEA Enhance	120 μl	480 μl
Nuclease-Free ddH2O	1ml	4×1ml

保存條件：-25~-15℃保存，避免反復凍融，保質期為一年。

注意事項：（請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項）
1．操作過程請注意避免核酸樣品和產物之間的交叉污染。
2．請使用不含RNA酶或DNA酶的槍頭、EP管進行試驗。
3．試驗開始前，請清潔操作臺，并使用RNA酶及DNA酶清除試劑，如RNase Away處理臺面。確保沒有RNA酶和DNA的污染。
4．進行文庫擴增前，請確保PCR儀已經調試好并處于穩定的狀態。
5．試驗前請仔細閱讀說明書，如果需要暫停試驗，或者無需立即進行下游試驗。可根據說明書推薦將試驗產物保存于-20℃并安排后續試驗。
6．由于使用本品所進行的片段化過程為酶促反應，故片段化過程對反應溫度、反應時間、體系配制以及DNA上樣量等因素較為敏感。強烈推薦用戶按照本說明書所述步驟及優化的反應參數（如反應時間等）進行試驗。

推薦使用的其他試劑：
1.Fast Ligation Reagent（WH0201-01/02）
2.NGS Library Amplification Reagent（WH0210-01/02）
3.Single-Index Adapter（Illumina)（WH0206-01/02/03）
4.BECKMAN Agencourt AMPure XP磁珠

操作步驟：

一、試驗準備
1.在開始實驗前，明確核酸的濃度及純度至關重要，推薦上樣量1ng~1μg DNA。DNA需溶解于以下溶液中：去離子水、10mM Tris、Buffer EB或LoTE（0.1×TE）等。
注意：
?確定上樣DNA濃度至關重要，尤其在上樣量低于100 ng時。推薦使用Qubit、Picogreen或者其他染料法對DNA濃度進行準確定量。
?請確認DNA溶液中不含陽離子及螯合劑。如果DNA溶解于1×TE或不確定DNA溶液中的EDTA濃度，請參照附錄Ⅰ所述步驟，使用BECKMAN公司的Agencourt AMPure XP磁珠進行純化或參照附錄Ⅲ進行片段化處理。
2.將各試劑置于冰上，5×FEA Enzyme Mix融化后用手指后輕彈混勻，不要渦旋。其余試劑可短暫渦旋混勻。

二、試驗步驟
1.照下表設置PCR儀反應程序。開啟熱蓋，熱蓋溫度設置為70℃。

操作步驟	溫度	時間
1	4℃	1min
2	32℃	3-24min*
3	65℃	30min
4	4℃	保持

*注：確切的片段化反應時間需要根據DNA的實際上樣量進行優化。下表1中列出10ng、100ng和1000ng上樣量DNA片段化所需的時間，用戶可以依據此時間進行調整。調整過程中，我們推薦額外設置一個反應時間延長3min以及一個縮短3min的對照。這樣有助于確定切割至所需片段大小時所需要的準確反應時間。關于片段化時長的更多建議，請參考附錄II。

表1：片段化時間選擇表（32℃)

DNA主峰大小	250bp	350bp	450bp	550bp
10ng DNA上樣量	24min	16min	14min	10min
100ng DNA上樣量	16min	10min	8min	6min
1000ng DNA上樣量	14min	8min	6min	4min

2.請按下表配制反應體系，冰上操作，各組分加入后，請輕柔吸打混勻，注意不要渦旋。

  當DNA上樣量＞10 ng

成分	用量
10×FEA Reaction Buffer	5 μl
DNA樣本	X μl
Nuclease-Free ddH2O	（35-X) μl
總體積	40 μl

  當DNA上樣量≤10 ng

成分	用量
10×FEA Reaction Buffer	5 μl
DNA樣本	X μl
FEA Enhancer	2.5 μl
Nuclease-Free ddH2O	（32.5-X) μl
總體積	40 μl

  注：對于多個反應，請計算所需試劑的總體系并在此基礎上增加體系10%，以避免因溶液轉移過程中掛壁損失而造成分裝反應數不足的問題。
3.取1個新的200 μl薄壁管置冰上，向管中加入10 μl 5×FEA enzyme Mix，隨后將（2）中反應體系轉移40 μl至同一薄壁管中，輕柔吸打混勻6-8次。
4.瞬時離心薄壁管，立刻置于已預冷至4℃的PCR儀中，并啟動反應程序。
5.當反應程序結束后，將薄壁管從PCR儀中取出并置冰上。
6.立即進入接頭連接步驟，為保證連接效率，推薦使用Fast Ligation Reagent（WH0201-01/02）。

附錄I：DNA樣品溶液中二價鹽離子以及EDTA的去除
請參照供應商提供的步驟進行純化。
1.若DNA溶液體積小于50 μl，請用無核酸酶的去離子水補足體積至50 μl。
2.加入90 μl（1.8倍體積）完全渦旋混勻的Agencourt AMPure XP磁珠至DNA溶液中，吸打混勻。若DNA溶液體積大于50 μl，請根據DNA溶液的實際體積，加入1.8倍體積完全渦旋混勻的Agencourt AMPure XP磁珠。
3.室溫孵育5 min后，將反應管置于磁力架上2~4 min收集磁珠，小心去除上清液。
4.用200 μl 80%乙醇洗滌磁珠，將反應管置于磁力架上收集磁珠，棄去上清。重復此洗滌步驟一次。
5.將反應管置于磁力架上，打開離心管蓋于室溫條件下晾置10 min或至磁珠干燥為止。
6.加入45 μl 10mM Tris-HCl（pH8.0）使磁珠完全懸浮后，置磁力架上2 min。待磁珠貼壁后小心轉移42.5 μl上清至新的離心管。
7.使用Quibit、Picogreen或其他熒光定量方法測定純化后的DNA濃度。

附錄II：優化片段化處理時間
片段化反應時間需要根據DNA上樣量進行優化，參考圖1所示曲線選擇反應時間。優化過程請使用將實際用于測序的DNA樣品，這將有助于在測序時保證片段化過程的可重復性。初次優化時，我們推薦添加2個額外的反應時間，即依據圖中曲線選擇反應時間后，在此時間基礎上分別延長和縮短3min。若對片段大小有較的要求，可在此基礎上繼續對反應時間進行微調。在實際操作中，若DNA上樣量≥10 ng，用戶可在片段化步驟完成后即對反應效果進行評價。具體方法為使用1.8倍體積AMPure@XP磁珠對反應產物進行純化，并將其溶解于10 μl Tris溶液或去離子水。然后使用Bioanalyzer High Sensitivity試劑盒確定片段分布。
對于上樣量＜10 ng的片段化反應，為了節省反應時間，我們推薦在每個反應體系中（50 μl）添加2.5 μl的FEA Enhancer。反應時間則推薦使用圖1中將10 ng DNA切割至特定片段大小所需時間的一半。例如：若期望DNA片段集中于350 bp，則加入FEA Enhancer后反應10 min左右即可。

圖1不同DNA上樣量經片段化后產出片段大小與反應時間對應曲線

附錄III：1×TE溶液中DNA的片段化/末端修復/A尾添加
當DNA溶解于1×TE溶液中時，請參照以下步驟進行DNA的片段化/末端修復/A尾添加反應。
1．按照下表設置PCR儀反應程序。請確認在反應中開啟熱蓋。如有可能，請將熱蓋溫度設置為70℃。DNA上樣量為1-1000ng。

反應步驟	反應溫度	反應時間
1	4℃	1min
2	32℃	5-35min*
3	65℃	30min
4	4℃	保持

*注：反應時間需根據DNA的實際上樣量進行優化。若DNA上樣量≥10 ng，反應體系中加入2.5 μl FEA Enhancer，推薦使用25 min作為起始反應時間，此時產生的片段主要集中于300-500 bp；若DNA上樣量＜10 ng，反應體系中加入5 μl FEA Enhancer，則推薦使用15 min作為起始時間，此時片段集中于300 bp。若需要進行調整，則請以3min為單位，在原反應時間基礎上進行增減，直至得到所需要的片段大小。

2．為了保證良好的試驗效果，請嚴格按照以下說明進行操作。在一個新的薄壁管中參照下表配制反應體系，此步請于冰上操作，配置好的反應體系經輕柔吸打混勻，注意不要渦旋震蕩。

  當DNA上樣量≥10ng

成分	用量
10×FEA Reaction Buffer	5μl
DNA樣本	X μl
FEA Enhancer	2.5μl
Nuclease-Free ddH2O	（32.5-X) μl
總體積	40μl

  當DNA上樣量＜10ng

成分	用量
10×FEA Reaction Buffer	5μl
DNA溶液	X μl
FEA Enhancer	5μl
Nuclease-Free ddH2O	（30-X) μl
總體積	40μl

1．取新的PCR薄壁管置冰上，加入10 μl 5×FEA Enzyme Mix。隨后將上一步準備好的反應體系轉移40 μl至同一薄壁管中。輕柔吸打混勻6-8次。注意操作過程中請保持反應管置于冰上。
2．將薄壁管瞬時離心后，立刻轉移至已預冷至4℃的PCR儀中，并啟動反應程序。
3．當反應程序結束，PCR儀溫度降至4℃后，將薄壁管從PCR儀中取出并置冰上。立即進入接頭連接步驟，為保證連接效率，推薦使用Fast Ligation Reagent（WH0209-01/02）。

根據您的關注的DNA片段化/末端修復/加dA尾試劑（Illumina)，您可能還對以下產品有需求：



名稱：基因定點突變試劑盒
貨號：YT027
規格：10次
本試劑盒可以用于點突變，多個鄰近密碼子的突變，單個或多個鄰近密碼子的缺失(deletion)或插入(insertion)。

本試劑盒是一個利用目前zuì新的基因點突變技術設計而成的試劑盒。只需通過基于PCR的突變質粒的合成，和基于Dpn I的模板質粒的消化，轉化培養以及后續的酶切或測序鑒定，即可得到預期的突變質粒(參考圖1)。累計操作時間不足2小時即可完成基因的定點突變。



參考上圖，使用本試劑盒時需要先設計長度通常為30個堿基以上的互補的兩個引物，在引物中含有預期的突變位點。然后以待突變的質粒為模板，用這兩個引物進行PCR擴增反應。這樣可以產生含有預期的突變位點的雙鏈質粒，但這個雙鏈質粒中有兩個nick位點。待突變的質粒通常來源于大腸桿菌等細菌，在細菌中會被甲基化修飾，而在體外通過PCR擴增得到的質粒不會被甲基化。這樣用甲基化酶Dpn I處理，可以消化掉待突變的質粒模板，而使通過PCR擴增出來的含有突變位點的質粒被選擇性地保留下來。這樣把Dpn I處理過的產物轉化細菌后，質粒中有兩個nick位點可以被大腸桿菌修復，得到的克隆就會含有預期的突變質粒了。

本試劑盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受態細菌的制備。

試劑盒組份：

Pfu DNA Polymerase	10μl
Reaction Buffer(10X)	100μl
dNTP Mix(2.5mM each)	50μl
Dpn I	10μl
DH5α 甘油菌	200μl
Nuclease-Free Water	1ml

儲存條件：-20℃，有效期一年。

使用說明：

1. 引物設計：
用于特定基因突變的引物需要單獨設計，請參考如下一些基本原則進行設計：
(1) 共需設計兩條互補的引物。可以先集中設計一條，然后就可以得到互補的另一條引物。
(2) 引物的長度通常為25-45個堿基。
(3) 引物中突變位點任何一側都必需滿足 4X(GC堿基數)＋2X(AT堿基數) ≥45。但引物也不宜過長，否則通常會形成非常穩定的二級結構。通常把突變位點兩側的堿基數控制在15個左右，且使兩側按照上述計算得到的數值相近。
例如引物為agtcaggccaattcgaagcagtcgaattgccaag，其中藍色的aag為突變位點，則
左側：4X(GC堿基數)＋2X(AT堿基數)＝4X8＋2X7＝46≥45
右側：4X(GC堿基數)＋2X(AT堿基數)＝4X8＋2X8＝48≥45
(4) 在可能的情況下，盡量把引物的GC含量控制在40％-60％。
(5) 在可能的情況下，盡量使引物不要產生非常穩定的二級結構和引物二聚體。二級結構和二聚體可以通過一些軟件進行分析。
(6) zuì好使用經過PAGE純化的引物或更高純度的引物。

2. 引物的配制：
如果合成得到的一個引物A的量是20nmol，另外一個互補引物B的量是19nmol。在引物A中加入200微升水，配制成濃度為100μM，在引物B中加入190微升水也配制成濃度為100μM。吸取20微升100μM引物A和20微升100μM引物B到一新的離心管中，再加入160微升水，混勻后即可得到可以直接用于基因定點突變反應的引物(10μM each)。

3. 待突變模板質粒的選擇：
選擇GC含量在40-55％的待突變模板質粒，并且每一個50bp左右的局部GC含量zuì好也不超過70%。如果GC含量過高，請先把目的基因克隆到其它合適的載體上，再進行基因定點突變反應。另外目的基因GC含量zuì好也在40-55％的范圍，并且每一個50bp左右的局部GC含量zuì好也不超過70%。如果目的基因GC含量過高，而突變位點不在高GC含量區域，可以先把該基因的不含高GC含量的一個區域克隆出來，進行定點突變，然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的質粒模板，或者有局部高GC含量的質粒模板，請另外使用專門用于高GC含量模板的PCR反應試劑。
必需使用從dam＋的大腸桿菌(這類菌中質粒可以被甲基化)中抽提得到的質粒用于基因定點突變。常用的大部分大腸桿菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。

4. 基因定點突變反應：
(1) 如下設置基因定點突變反應體系：
Nuclease-Free Water———>?μl
Reaction Buffer (10X)——>5μl
引物 (10μM each)————>2μl
dNTP Mix (2.5mM each)——>4μl
待突變模板質粒(0.5μg)——>?μl
總體積——————————>49μl
按照上面的順序依次加入各種試劑。在上述反應體系中，根據待突變模板質粒的量，計算出需加入的Nuclease-Free Water的量，使總體積為49微升。適當混勻后，加入 1 ul Pfu DNA Polymerase，混勻。如果用的PCR儀沒有熱蓋，在反應體系上加入一滴礦物油(mineral oil)以防止蒸發。
(2) 按照如下參數設置PCR儀：

步驟	循環數	溫度	時間	說明
1	1	95℃	1分鐘	zuì初變性
2	18	95℃	40秒	變性
		60℃	1分鐘	退火
		68℃	1分鐘/kb	延伸
3	1	72℃	10分鐘	延伸、補全
4	1	4℃	長時間保持	暫時存放

說明：上面表格中1分鐘/kb表示，如果待突變的質粒為6kb，那么68℃的延伸時間為6分鐘。

5. Dpn I消化：
PCR反應后，直接在PCR反應體系中加入1微升Dpn I，混勻后37℃孵育1小時。37℃孵育可以在PCR儀上進行，也可以在水浴鍋中進行。Dpn I消化完畢后可以直接用于轉化，或者-20℃保存備用。

6. 轉化、挑克隆鑒定：
感受態細菌的轉化效率必需至少在107以上，否則很難得到克隆。根據所使用的感受態細菌，加入盡量多的經過Dpn I消化后的突變產物用于轉化。通常每100微升感受態細菌中可以加入5-10微升經過Dpn I消化后的突變產物。按照所使用的感受態細菌的操作方法進行操作，在涂板前通過離心濃縮的辦法，把所有被轉化后的細菌，全部涂布到含有適當抗生素的平板上，培養過夜。通常會得到50個以下的克隆。如果發現克隆有上千個，那么肯定是有什么地方出了問題。
對于得到的克隆，可以先挑克隆小抽酶切鑒定。以確認得到的質粒的大小和質粒中插入片斷的大小與預期結果是否相符。
取3-5個酶切鑒定正確的克隆去測序，以zuì終確認得到的克隆是否是預期的突變克隆。通常大約每2個克隆中會得到一個預期的突變克隆。但有時也可能會因為隨機因素，會測序了3-5個克隆才得到一個預期的突變克隆。

關注DNA片段化/末端修復/加dA尾試劑（Illumina)，的同時，為您推薦更多您可能感興趣的產品：

貨號	名稱	規格
WE0228	二代測序DNA快速建庫試劑盒(Ion Torrent平臺)	24次|96次
ZN0141	BMP-8 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0202	Catenin β mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0239	CD1C mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0254	CD44V9 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0520	FIH mRNA原位雜交試劑盒	100T

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