北京百奧萊博供應的零背景快速連接試劑盒（不含MCS用于科學研究，我公司專注于克隆與表達產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和供應，為您提供的零背景快速連接試劑盒（不含MCS質量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產(chǎn)品。...

特別提示：包括零背景快速連接試劑盒（不含MCS)在內，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：零背景快速連接試劑盒（不含MCS)
英文名稱：Zero-Background Simple Fast Cloning Kit（without MCS)
產(chǎn)品貨號：WH0192
產(chǎn)品規(guī)格：20次

本試劑盒是一種陽性選擇克隆系統(tǒng)，可以克隆各種PCR產(chǎn)物和任何具有平末端或粘性末端的DNA片段。該試劑盒對磷酸化或非磷酸化的DNA片段都有效。陽性選擇載體和插入片段連接僅需5min即可獲得超過95%的陽性重組克隆。由具有校正活性的聚合酶（如：Pfu Polymerase）擴增的平末端PCR產(chǎn)物可直接連入克隆載體。由無校正活性的聚合酶（如：Taq Polymerase）或聚合酶混合物擴增的PCR產(chǎn)物在連接前需用試劑盒提供的熱穩(wěn)定DNA平端化酶進行末端平端化（7 min）即可。連接產(chǎn)物可直接轉化常用的大腸桿菌菌株。

試劑盒提供一個新穎的即用型陽性選擇克隆載體。該載體含有致死基因，克隆位點處插入外源片段會引起基因失活，因此只有轉化了重組質粒的細菌才能存活形成克隆菌落。而自身環(huán)化的pLB-simple Vector表達致死毒性蛋白（無外源片段插入），轉化后殺死大腸桿菌細胞。這種陽性篩選策略無需藍白斑篩選，大地加速了克隆篩選進程。

產(chǎn)品特點：
·快速：零背景無需藍白斑篩選，5min快速連接。
·靈敏廣泛：適合低濃度片段和長片段連接，適合平/粘末端連接。
·無多克隆位點：方便客戶自行引入酶切位點進行亞克隆。

載體圖譜：



試劑盒組成：

組分	規(guī)格
Simple Vector（35ng/μl)	20μl
T4 DNA Ligase（3U/μl)	20μl
2×Reaction Solution	100μl
Blunting Enzyme	10μl
Forward Sequencing Primer（10μM)	200μl
Reverse Sequencing Primer（10μM)	200μl
Control Insert DNA（700bp,50ng/μl)	10μl
ddH2O	1ml

保存條件：-20℃保存，避免反復凍融。
Forward Sequencing Primer，23-mer：5"-CGACTCACTATAGGGAGAGCGTC-3"
Reverse Sequencing Primer，24-mer：5"-AAGAACATCGCTTTTCGATGGCAG-3"

不同片段使用量：
1．載體與片段的摩爾比控制在1:3-1:10，對于1kb以下的片段建議使用1:3的比例，1kb以上的片段建議使用1:7的比例。
2．請根據(jù)凝膠電泳或紫外分光光度計檢測后的濃度和片段長度來計算其摩爾比。插入片段用量，可根據(jù)以下公式粗略計算：
  插入片段用量ng=（3～10)×插入片段長度/載體長度×載體用量ng
  連接體系中35ng的載體，不同大小的PCR產(chǎn)物zuì佳加入量舉例如下：

PCR產(chǎn)物長度	zuì佳的使用量
700bp	25ng
2000bp	165ng

注意事項：請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項。
1．轉化過程中使用對照片段做對照是非常必要的，在實驗出現(xiàn)問題時可以確定原因。
2．建議留下部分連接產(chǎn)物，在出現(xiàn)問題后能迅速的補救，減少不必要的重復實驗。
3．涂布用量可根據(jù)具體實驗作相應調整。如轉化的DNA總量較多，可取更少量轉化產(chǎn)物涂布平板；反之，如轉化的DNA總量較少，可取200-300μl轉化產(chǎn)物涂布平板。如果預計的克隆較少，可通過離心（4000rpm，2 min）后吸除部分培養(yǎng)液，留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后將其涂布于一個平板中（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板）。

使用方法（以下的步驟請在無菌條件下操作）
一、平末端連接方法：
  ?用于高保真耐熱DNA聚合酶產(chǎn)生的具有平末端的PCR產(chǎn)物的克隆。
  ?若由其他耐熱聚合酶產(chǎn)生的粘性末端的PCR產(chǎn)物進行克隆時，請行平端化，詳見“粘末端連接方法”。
  ?本方法也適用于由限制性內切酶產(chǎn)生的平末端的DNA片段，連接前DNA片段應使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收，載體與片段的摩爾比參考“不同片段使用量”的介紹。
1．按照下表的內容在無菌的離心管中加入各種成分

成分	使用量
目的PCR片段	X μl
Simple Vector（35ng/μl)	1 μl
2×Reaction Solution	5 μl
T4 DNA Ligase（3U/μl）	1 μl
ddH2O	補足至10 μl

  輕彈離心管以混勻反應液，短暫離心3-5 sec。
2．將混合反應液放置室溫（22℃）反應5min。反應結束后，將離心管置于冰上，進行后續(xù)的轉化反應。
  注意：如果插入片段長度大于3 kb，可以將反應時間zuì大延長至30 min。

二、粘性末端連接方法：
  ?用于Taq DNA Polymerase或含有Taq DNA Polymerase的混合酶產(chǎn)生的3′端帶A的PCR產(chǎn)物的克隆。
  ?如果PCR產(chǎn)物末端的結構不明確，請使用粘性末端連接方法。
  ?本方法也適用于由限制性內切酶產(chǎn)生的5"或3"帶有突出端的DNA片段，連接前DNA片段應使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收，載體與片段的摩爾比參考“不同片段使用量”的介紹。
1．按照下表的內容在無菌的離心管中加入各種成分，進行平端化反應。

成分	使用量
Insert DNA	X μl
2×Reaction Solution	5 μl
Blunting Enzyme	0.5 μl
ddH2O	補足至8 μl

  輕彈離心管以混勻反應液，短暫離心3-5 sec。
2．將混合反應液置于20℃反應2 min，然后置于70℃反應5min，放在冰上短暫冷卻。
3．向平端化的反應體系中加入下列成分

成分	使用量
Simple Vector （35ng/μl)	1μl
T4 DNA Ligase（3U/μl)	1μl

4．將混合反應液置于室溫（22℃）反應5min。反應結束后，將離心管置于冰上，進行后續(xù)的轉化反應。
  注意：如果插入片段長度大于3kb，可以將反應時間zuì大延長至30min。

對照實驗：（實驗方法同粘性末端連接）
1．按照下表的內容在無菌的離心管中加入各種成分，進行平端化反應。

成分	使用量
Control Insert DNA（700bp,50ng/μl)	0.5μl
2×Reaction Solution	5μl
Blunting Enzyme	0.5μl
ddH2O	補足至8μl

  輕輕彈動離心管以混勻內容物，短暫離心3-5 sec。
2．將混合反應液置于20℃反應2 min，然后置于70℃反應5min，放在冰上短暫冷卻。
3．向平端化的反應體系中加入下列成分

成分	使用量
Simple Vector（35ng/μl)	1μl
T4 DNA Ligase（3U/μl)	1μl

  輕彈離心管以混勻反應液，短暫離心3-5 sec。
4．將混合反應液置于室溫（22℃）反應5min。反應結束后，將離心管置于冰上，進行后續(xù)的轉化反應。

轉化
1．制備含有氨芐青霉素終濃度100μg/ml的LB瓊脂糖平板。將平板放置在37℃，至少預熱20min。
2．轉化
a．取部分連接產(chǎn)物加到50～100μl 0感受態(tài)細胞中（感受態(tài)細胞應剛從-70℃冰箱取出放于冰浴上，待剛剛解凍時加入連接產(chǎn)物，連接產(chǎn)物的加入量不超過感受態(tài)細胞體積的十分之一），輕彈混勻，冰浴30min（必要時請使用超螺旋質粒pUC19同步轉化感受態(tài)細胞作為對照檢測轉化效率，將0.1ng pUC19加入另一只感受態(tài)細胞管中，其余的操作步驟與連接產(chǎn)物的轉化步驟同步進行）。
b．將離心管置于42℃恒溫90sec，取出管后立即置于冰浴中放置2-3min，其間不要搖動離心管。
c．向離心管中加入250～500μl 37℃預熱的LB（不含抗生素）培養(yǎng)基，150rpm、37℃振蕩培養(yǎng)45min。目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。
d．將離心管中的菌液混勻，吸取100μl加到含氨芐青霉素的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16h。

檢測
1．常規(guī)檢測：將得到的菌落接種1-5ml LB（含有終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素）培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜，保存菌種后提取質粒，應用PCR或酶切方法鑒定插入片段是否正確。
  Control Insert DNA的PCR鑒定，請參考以下反應條件：

2．快速檢測：挑取菌落直接進行PCR檢測。
3．測序鑒定：使用常規(guī)或快速方法進行初步的鑒定后進行序列的測定。

反應體系：
標準體系為10μl體積，5μl的反應體系也能取得很好的效果，試劑用量減半。

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