0電擊感受態(tài)細(xì)胞由專業(yè)試劑供應(yīng)商北京百奧萊博提供，用于科研目的，0電擊感受態(tài)細(xì)胞是我司眾多優(yōu)質(zhì)克隆與表達(dá)之一，質(zhì)量堪比同類進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格非常優(yōu)惠，目前正熱烈促銷中，恭候您的咨詢訂購。...

特別提示：包括0電擊感受態(tài)細(xì)胞在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：0電擊感受態(tài)細(xì)胞
英文名稱：0 Electroporation-Competent Cell
產(chǎn)品貨號：MQ0026
產(chǎn)品規(guī)格：5×50μl/20×50μl

0電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。0來源于MC1061菌株，是目前實(shí)驗(yàn)室zuì常用的感受態(tài)細(xì)胞之一，基因型與DH10B 高度類似(DH10B為galE15型，而0為galU型)。0生長速度快(比DH5α快，但比Mach1-T1生長速度慢)，10小時(shí)可見克隆。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。可用于構(gòu)建克隆，藍(lán)白斑篩選等實(shí)驗(yàn)，具有鏈霉素抗性。0電擊感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×1010 cfu/μg DNA。
保存條件：-80℃
基因型：
F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80 lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araΔ139Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(Strr)endA1 nupG
操作說明：
1.0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
2.取-80℃保存的0電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5分鐘，待其融化，加入目的DNA(質(zhì)粒或連接產(chǎn)物)并用手撥打EP管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。
A.測定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質(zhì)粒pUC19；
B.對于連接產(chǎn)物，請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液(10 mM Tris HCl，pH7.5;1 mM EDTA)重懸，DNA濃度不超過100 ng/μl，體積不超過5 μl/50 μl感受態(tài)。
3.用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。
4.啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV(此為BioRad電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作)，將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。
5.2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入1ml不含抗生素的無菌S.O.C.培養(yǎng)基(室溫)，用1ml槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到50 ml離心管(BD Falcon 50 ml錐形離心管等)，向離心管中補(bǔ)加S.O.C.培養(yǎng)基至10 ml。傾斜45度放入搖床，37℃，225 rpm復(fù)蘇60分鐘。
6.5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大，若全部涂板請選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個(gè))。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)13-17小時(shí)。
注意事項(xiàng)：
1.加入DNA時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。
2.電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)增加弧光放電風(fēng)險(xiǎn)。
3.當(dāng)DNA不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時(shí)，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。
4.電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和DNA的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。
5.若轉(zhuǎn)化大質(zhì)粒或想獲得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級。
6.對于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，zuì好轉(zhuǎn)化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液(10 mM Tris HCl，pH7.5;1 mM EDTA)重懸產(chǎn)物，保證 DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，增加弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。
7.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時(shí)避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒或連接產(chǎn)物可相應(yīng)減少zuì終用于涂板的菌量。
8.電擊感受態(tài)細(xì)胞zuì好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降。

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名稱：pUCm-T載體
貨號：BTN160101
規(guī)格：1μg
本產(chǎn)品是一種克隆PCR產(chǎn)物(TA Cloning)的專用載體。本載體由pUC系列載體改造而成，在pUC載體的多克隆位點(diǎn)處插入特殊的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，酶切后能在載體的3′端形成懸掛的“T”末端。很多DNA聚合酶在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)會(huì)在PCR產(chǎn)物雙鏈DNA 每條鏈的3′端加上一個(gè)突出的堿基A。這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產(chǎn)物的兩端進(jìn)行正確的AT 配對，在連接酶的催化下，就可以把PCR產(chǎn)物連接到，pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的重組載體。可以通過藍(lán)白斑篩選有插入片斷的重組克隆，大大提高了3′末端A 突出PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。本產(chǎn)品應(yīng)用于進(jìn)行TA 克隆，克隆PCR產(chǎn)物。對克隆后的PCR產(chǎn)物可以用M13通用引物進(jìn)行DNA 測序。

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1. PCR產(chǎn)物3′末端帶有突出的A堿基：Taq、Tth、Ampli Taq、Klen Taq DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物3′末端均帶有突出的A堿基。建議擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收，再進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
2. PCR產(chǎn)物3′末端沒有突出的A堿基：Pfu、Pwo、Tli或DeepVent等DNA聚合酶具有3′5′外切酶活性，其擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物末端可能不帶有3′A，要對這種平末端PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，應(yīng)先對其進(jìn)行3′末端加A，再進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

二.連接反應(yīng)
3.在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的10mL連接反應(yīng)體系中，加入下列成分：

反應(yīng)組分	10μl反應(yīng)體系
插入的目的片段	xμL(0.2 pmol)
本產(chǎn)品	1μL(50 ng)
10×連接酶緩沖液	1μL
T4 DNA連接酶	3-5 U
補(bǔ)水到	10 L

 注意:一般zuì后加入T4 DNA連接酶。
4. 用移液器吹打反應(yīng)混合液使之混勻后，16-23℃連接1～12小時(shí)(或按T4 DNA連接酶供貨商提供的操作手冊進(jìn)行連接)。

三．細(xì)菌轉(zhuǎn)化和鑒定
5. 將100μl感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍后，完全解凍后輕輕將細(xì)胞均勻懸浮。
6. 加入上述5μl連接液，輕輕混勻，冰上放置30分鐘。
7. 42℃水浴熱激90秒，再冰上放置15～20分鐘。
8. 加入400μl自備的SOC培養(yǎng)基，37℃ 200～250rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。
9. 4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉400μl上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮。
10. 將細(xì)菌懸液均勻涂布在含20μl的IPTG(100mM)和100μl的X-gal(20mg/mL)的氨芐青霉素抗性的自備的LB平板上。(涂布菌液的用量可以根據(jù)連接的效率及感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率而進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。)
11. 將平板于37℃培養(yǎng)1小時(shí)，然后倒置培養(yǎng)過夜。(先將平板正向放置1小時(shí)，以吸收過多的液體。)

四．篩選
12.轉(zhuǎn)化子的藍(lán)白篩選：
 當(dāng)外源DNA片段插入到pUCm-T載體中后，由于外源DNA的核酸序列存在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產(chǎn)物β-半乳糖苷酶α-片段的活性，因此重組克隆在-gal/IPTG 平板上呈現(xiàn)為白色，而非重組克隆呈藍(lán)色。選擇在IPTG/X-gal 平板上生長的白色菌落，用牙簽挑至含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。
13.轉(zhuǎn)化子的鑒定：
1)用上述培養(yǎng)的白色菌落的菌液抽提質(zhì)粒，用PstI單酶切或用其它合適的酶切,瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定是否含有目的片段。
2)用M13通用引物或其它合適的引物直接進(jìn)行測序來確定是否含有目的克隆。

操作提示：
1. PCR產(chǎn)物的純度：
 連接反應(yīng)前需用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物，如果電泳檢測PCR產(chǎn)物條帶彌散，或出現(xiàn)非特異條帶，則需要切下目的條帶，用膠回收試劑盒對目的片段進(jìn)行回收。若PCR產(chǎn)物電泳檢測只有預(yù)期大小的明顯條帶，也應(yīng)使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒直接純化PCR產(chǎn)物，以除去引物二聚體。不經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物在某些條件下可直接用于連接，但由于引物二聚體和PCR產(chǎn)物中其它物質(zhì)的影響，造成含有插入片段的陽性克隆數(shù)減少，因而需要篩選很多克隆方可得到含有目的PCR產(chǎn)物的陽性克隆。
2. 平端PCR產(chǎn)物
 具有校正活性的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶如Pfu、Pwo、Tli在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生平端PCR產(chǎn)物。這種平端PCR產(chǎn)物可以進(jìn)行3′末端加A 尾后連接到pUCm-T載體中，采用這種方法進(jìn)行連接，可大大提高克隆的效率。
3.優(yōu)化插入片段和載體的摩爾比
1)pUCm-T載體優(yōu)化的插入DNA片段和載體的摩爾比為3:1，采用3-10:1的連接比例也可成功進(jìn)行連接。如果你的PCR產(chǎn)物開始連接的不理想，則有必要優(yōu)化連接比例。
2)PCR產(chǎn)物的量可采用以下公式進(jìn)行換算：
PCR片段的量(ng)= [加入載體的量(ng)×插入片段大小(kb)/載體大小(kb)]×插入片段和載體的摩爾比
4.篩選含插入片段的轉(zhuǎn)化子
插入片段成功克隆到pUCm-T載體中，可阻斷β-半乳糖苷酶的編碼序列，因而重組克隆可在指示培養(yǎng)基上通過顏色進(jìn)行篩選。大多數(shù)情況下含有PCR產(chǎn)物的克隆菌為白色，如果PCR片段和LacZ基因在同一讀碼框內(nèi)，即PCR片段堿基數(shù)是3的整數(shù)倍(含3′-A)，并且讀碼框無終止密碼子，則重組克隆菌可能為藍(lán)色。

質(zhì)粒圖譜：


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