核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒提供全套試劑，適用于從各種原代或傳代細(xì)胞和各種實(shí)體組織，如腦、脊髓、神經(jīng)結(jié)或纖維、脂肪、肝臟、消化道、腎臟、心臟、肌肉、血管、結(jié)締組織等哺乳動(dòng)物組織中提取核蛋白和胞漿蛋白。提取過(guò)程簡(jiǎn)單方便，可在1小時(shí)內(nèi)完成。制備的核蛋白和胞漿蛋白不僅純度高，保持天然活性，而且絕少交叉污染。...

使用注意事項(xiàng)：

● 旋帽離心管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

● 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個(gè)過(guò)程須保持樣品處于低溫。

● 蛋白酶抑制劑儲(chǔ)存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

● 蛋白酶抑制混合物避免反復(fù)凍融。

● 如果試劑不能短時(shí)間內(nèi)用完，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

● 可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

使用方法：

細(xì)胞蛋白提取

1、提取液制備：

每200μL蛋白提取液A中加入1μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

每200μL蛋白提取液B中加入1μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】

● 根據(jù)需要處理的樣品數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

● 加過(guò)蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

● 蛋白樣品用于測(cè)定某些細(xì)胞內(nèi)蛋白酶活性等下游實(shí)驗(yàn)時(shí)，注意據(jù)實(shí)際情況調(diào)整抑制劑混合物是否加入。

● 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2、取5-10×10⁶個(gè)細(xì)胞，在4℃，1000×g離心5分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞。

【注】：

● 細(xì)胞數(shù)量根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況調(diào)整，每次的裂解液用量并不是一定的，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。

3、用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

【注】：

● 在1000×g條件下離心5分鐘。

4、每20μL體積細(xì)胞沉淀（約20mg,2×10⁶）中加入200-300μL冷的提取液A，高速渦旋振蕩15秒或吹打混勻，置2-8℃條件下振蕩15-30分鐘。

【注】：

● 用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持提取液輕微晃動(dòng)即可。

● 沒(méi)有振蕩條件可以不振蕩，稍微延長(zhǎng)處理時(shí)間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。

● 如果部分細(xì)胞不能完全裂解，導(dǎo)致核蛋白純度低，可以延長(zhǎng)振蕩時(shí)間。

5、然后在4℃，1000×g條件下離心10分鐘。

6、將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到胞漿蛋白，請(qǐng)置于冰上或-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

7、沉淀用PBS洗滌一次，在4℃，1000×g條件下離心5分鐘，棄上清。

8、在沉淀中加入200μL冷的提取液B，高速渦旋振蕩5秒。

【注】：

● 根據(jù)后面和蛋白濃度測(cè)定的情況，可調(diào)整使用量，一般在50-200μL。

● 加提取液B前，必須盡可能吸干提取液A，否則會(huì)影響核蛋白純度。

● 也可以用PBS將沉淀洗滌一次。PBS重懸沉淀，12000×g離心5分鐘。

● 提取液B用量根據(jù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)量情況調(diào)整，細(xì)胞數(shù)量多則多加。也可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)最終蛋白濃度實(shí)際情況調(diào)整。

9、置2-8℃條件振蕩30分鐘，至沉淀明顯減少甚至無(wú)明顯沉淀。

【注】：

● 用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持提取也輕微晃動(dòng)即可。

● 沒(méi)有振蕩條件可以不振蕩，稍微延長(zhǎng)處理時(shí)間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。

10、在4℃，14000×g條件下離心10分鐘。

11、將上清吸人另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到核蛋白。

12、將上述蛋白提取物定量分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。

【注】：

● 建議用BCA法進(jìn)行蛋白定量。

● 蛋白樣品-80℃存放一年沒(méi)有問(wèn)題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

組織蛋白提取

1、提取液制備：

每200μL蛋白提取液A中加入1μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

每200μL蛋白提取液B中加入1μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】：

● 根據(jù)需要處理的樣品數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

● 加過(guò)蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

● 蛋白樣品用于測(cè)定某些細(xì)胞內(nèi)蛋白酶活性等下游實(shí)驗(yàn)時(shí)，注意據(jù)實(shí)際情況調(diào)整抑制劑混合物是否加入。

● 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2、取適量組織樣本，用手術(shù)剪刀盡可能剪碎，加冷PBS，用組織勻漿機(jī)/勻漿器勻漿至無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)固體，冰上靜置5分鐘，小心將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。

3、在4℃，500×g條件下離心5分鐘，棄上清。

4、每20mg組織（20-30μL細(xì)胞沉淀體積）中加入200μL冷的提取液 A，高速渦旋振蕩15 秒或吹打混勻，置2-8℃條件下振蕩20-30分鐘。

【注】：

● 用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持提取液輕微晃動(dòng)即可。

● 沒(méi)有振蕩條件可以不振蕩，稍微延長(zhǎng)處理時(shí)間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。

● 如果部分細(xì)胞不能完全裂解，導(dǎo)致核蛋白純度低，可以延長(zhǎng)振蕩時(shí)間。

5、然后在4℃，1000×g條件下離心10分鐘。

6、將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到胞漿蛋白，請(qǐng)置于冰上或-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?

7、沉淀用PBS洗滌一次，在4℃，1000×g條件下離心5分鐘，棄上清。

8、在沉淀中加入100μL-200μL冷的提取液B，高速渦旋振蕩5秒。

【注】：

● 加提取液B前，必須盡可能吸干提取液A，否則會(huì)影響核蛋白純度。

● 也可以用PBS將沉淀洗滌一次。PBS重懸沉淀，12000×g離心5分鐘。

● 提取液B用量根據(jù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)量情況調(diào)整，細(xì)胞數(shù)量多則多加。也可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)最終蛋白濃度實(shí)際情況調(diào)整。

9、置2-8℃條件振蕩30-40分鐘，至沉淀明顯減少甚至無(wú)明顯沉淀。

【注】：

● 用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持提取也輕微晃動(dòng)即可。

● 沒(méi)有振蕩條件可以不振蕩，稍微延長(zhǎng)處理時(shí)間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。

● 此步驟蛋白提取液處理產(chǎn)物中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的蛋白復(fù)合物。不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的特定蛋白的情況下，可以直接離心取上清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)即可；如果需要檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過(guò)超聲處理，300w/10秒間隔10秒，超聲3分鐘，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)一些常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時(shí)，不必進(jìn)行超聲處理。如果引入其他外源性蛋白質(zhì)不影響下游實(shí)驗(yàn)的話，也可以加入DNase處理。

10、在4℃，12000×g條件下離心10分鐘。

11、將上清吸人另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到核蛋白。

12、將上述蛋白提取物定量分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。

【注】：

● 建議用BCA法進(jìn)行蛋白定量。

● 蛋白樣品-80℃存放一年沒(méi)有問(wèn)題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

常見(jiàn)問(wèn)題分析：

● 細(xì)胞裂解速度慢？

為了充分保證提取得到的蛋白的活性，提取液采用獨(dú)特的保護(hù)蛋白的配方，裂解能力溫和，下游應(yīng)用范圍廣。適當(dāng)延長(zhǎng)裂解時(shí)間。

● 蛋白濃度低？

處理部分樣本可能沒(méi)有裂解完全，導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當(dāng)延長(zhǎng)試劑A和試劑B的處理時(shí)間即可。最好在持續(xù)振蕩條件下處理，沒(méi)有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

● 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法，不適合用Bradford法，因?yàn)樵噭?/span>A中含有干擾Bradford法的組分，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過(guò)透析處理或者用脫鹽柱改換過(guò)緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

● 提取時(shí)出現(xiàn)膠狀沉淀？

蛋白提取液B處理產(chǎn)物中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)少量透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的特定蛋白的情況下，可以直接離心取上清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)即可；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過(guò)超聲處理，300w/10秒間隔10秒，超聲3分鐘，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)一些常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時(shí)，不必進(jìn)行超聲處理。

● 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒(méi)有對(duì)蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。

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