單線態氧檢測試劑盒是利用單線態氧特異性熒光探針單線態氧探針O22檢測單線態氧的試劑盒。單線態氧探針O22是合成的苯蒽類熒光探針,可以自由穿過細胞膜,進入細胞內后,與細胞內單線態氧反應,被氧化生成綠色熒光物質,綠色熒光強度與細胞內單線態氧水平成正比,檢測綠色熒光就可以知道細胞內單線態氧的變化情況。...

產品特點：

● 使用方便：可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察、熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測；

● 背景低,靈敏度高；

● 線性范圍寬,使用方便。

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 激光共聚焦顯微鏡或熒光分光光度計或酶標儀或流式細胞儀,激發波長500±10nm,發射波長530±10nm,或者按照FITC熒光檢測條件檢測。

● 離心機 ● 移液器 ● PBS緩沖液(pH7.4,1×)● HBSS(含鈣鎂,不含酚紅)

使用注意事項：

● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內壁上的液體收集至管底,避免開蓋時液體灑落。

● 熒光探針標記后,一定要洗凈殘余未進入細胞內的探針,否則導致背景較高。

● 探針標記完畢并洗凈殘余探針后,可以進行激發波長的掃描和發射波長的掃描,以確認探針的標記情況是否正常。

● 盡量縮短探針標記后到測定所用的時間,以減少各種可能的誤差。

● 單線態氧O22在光照和空氣中易被氧化,注意避光密封保存。

● O22染色工作液必須現配現用,并且在當天用完。

● O22對濕度非常敏感,若是O22溶液每次取完需要量后,必須緊緊密封蓋子。建議根據單次用量,分裝密封保存。不可使用含水的吸頭。

● 對不同的細胞和組織,應選擇合適的孵育時間和濃度,以觀察單線態氧的變化,很多細胞內的單線態氧絕對水平較低,需要根據實際情況適當延長孵育時間。

● 單線態氧O22探針可以根據需要的用量分裝后凍存,避免反復凍融。

● 單線態氧O22不可一次性全稀釋后長期保存,稀釋后穩定性變差,有效期縮短。

● 單線態氧含量高則細胞熒光強度強。

● 以下操作步驟僅供參考，請根據實際樣本情況調整或參考文獻。可以用熒光酶標儀、共聚焦/顯微鏡等原位檢測，也可以收集后染色用流式細胞儀等檢測。

使用方法：

單線態氧探針O22配制：

根據樣本數量計算需要的用量,用探針稀釋液5倍稀釋單線態氧O22探針后充分混勻,避光保存備用。 稀釋后的單線態氧O22熒光探針最好在一個月內用完,盡量避免反復凍融。

【注】：

● 可以不用試劑盒的稀釋液,直接用HBSS或不含血清的培養基稀釋。

● 不可以一次性將探針全部稀釋。

● 也可以不稀釋探針，直接在待檢測樣本中加入0.5-1μL探針（100μL體系），但是需要用好的移液器和吸頭，注意操作過程，保證探針有效的加入了樣品中，并充分混勻。

● 現配現用。

● 沒用完的稀釋后的單線態氧O22熒光探針保存在4℃冰箱，最好在一周內用完，盡量避免反復凍融。

單線態氧O22探針標記：

單線態氧O22溶液可在新鮮無血清培養基、HBSS緩沖鹽溶液或組織灌流液中稀釋到所需濃度,終濃度按試劑盒的母液的100-200倍稀釋,以此染色液更換細胞培養液或灌流液；也可直接向無血清細胞孵育液體或灌流液中加入單線態氧O22探針溶液至所需濃度。

原位標記：僅適用于貼壁培養細胞。

1、按照1:100-200用無血清培養基稀釋單線態氧O22探針。

【注】：

● 不能用含有血清的培養基稀釋O22探針。

● 也可以用HBSS或PBS緩沖液稀釋探針。

● 如果是前面已經5倍稀釋過的探針，此步再次進行20-40倍稀釋，或者直接一次性100-200倍稀釋。

2、去除細胞培養基，用PBS洗細胞一次。

【注】：

● 加入PBS再吸出。

3、加入適當體積稀釋好的O22探針。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于96孔板每孔加入100-200μL染色液，6孔板一個孔加入稀釋好的O22探針不少于1mL。

4、在37℃細胞培養箱內避光孵育20-60分鐘。

【注】：

● 若染色不夠充分，延長染色時間。

● 依據細胞單線態氧含量的不同，單線態氧O22探針終濃度可以選擇在100-200倍稀釋的范圍，孵育時間可以選擇20分鐘-4小時，通常30分鐘左右即可。在37℃或室溫進行避光孵育。

5、用無血清細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的O22探針。

【注】：

● 也可以用HBSS/PBS洗滌細胞。

● 漂洗時間要短。

6、熒光酶標儀/共聚焦/顯微鏡檢測。

收集后標記：懸浮細胞或貼壁細胞消化處理

1、按照1:100-200用無血清培養基稀釋單線態氧O22探針。

【注】：

● 不能用含有血清的培養基稀釋O22探針。

● 也可以用HBSS或PBS緩沖液稀釋探針。

● 如果是前面已經5倍稀釋過的探針，此步再次進行20-40倍稀釋，或者直接一次性100-200倍稀釋。

2、離心移除培養基，用PBS洗細胞一次。

【注】：

● 500×離心5分鐘。

3、細胞收集后懸浮于稀釋好的O22探針中，細胞濃度為1×10⁶-2×10⁷/mL，37℃細胞培養箱內避光孵育20-60分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。

【注】：

● 若染色不夠充分，延長染色時間。

4、用無血清細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的O22探針。

5、用無血清細胞培養基重懸細胞。

【注】：

● 也可以用HBSS或PBS洗滌細胞。

6、流式細胞儀/顯微鏡檢測。

熒光顯微鏡觀察：

1、對貼壁生長細胞或活組織,可直接在熒光顯微鏡下觀察；對懸浮生長細胞,取25-50μL細胞懸液滴到一張顯微載玻片上,再蓋上一張蓋玻片。

2、熒光顯微鏡下觀察。

激發波長488nm，發射波長526nm。

【注】：

● 單線態氧含量高則細胞熒光強度強。

流式細胞儀分析：

1、對貼壁生長細胞,用胰酶消化制備成單細胞懸液；對懸浮生長細胞,直接收集細胞。染色并洗滌后用用0.5～1mL冰冷PBS重懸細胞(5～10萬)。

2、采用488nm波長激發,測定待測細胞平均熒光強度。

使用488nm激發波長,525nm發射波長,實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱變化情況。

【注】：

● 單線態氧含量高則細胞熒光強度強。

● 探針O22熒光光譜和FITC非常相似,可以用FITC的參數設置檢測探針O22產物。

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