DAPI(diamidino-2-phenylindole) 能與雙鏈DNA小槽，特別是AT堿基結合，也可插入少于3個連續AT堿基對的DNA序列中。當它與雙鏈DNA 結合時，熒光強度增強20倍，而與單鏈DNA 結合則無熒光增強現象，因此是一種簡易、快速和敏感地檢測DNA 的方法。DAPI的熒光強度較Hoechst低，但熒光穩定性優于Hoechst；其特異性較溴化乙啶和碘化...

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 流式細胞儀/熒光顯微鏡/激光共聚焦 ● 離心機 ● 移液器 ● PBS/HBSS（無酚紅）

注意事項：

● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

● 染色后立即進行分析。

● 染色時間根據不同樣本的實際染色結果做相應調整。

● 本染色液可用于培養細胞、細胞涂片、石蠟切片、冰凍切片的檢測。石蠟切片用常規方法脫蠟、分化、冰凍切片用冰丙酮固定后檢測。

● 據樣本情況和下游檢測儀器選擇合適的染色方法，只要在染色時染色工作液能充分覆蓋細胞樣本即可。

● 活細胞原位染色不同細胞需要的時間差異較大，可能需要較長時間，可將染液加入培養基后避光孵育30分鐘-4小時，或更長時間。

● 以下以培養細胞的涂片的熒光顯微鏡檢測為例，細胞染色不需要固定，也可以固定后染色。以下方法僅供參考，也可以參閱相關資料使用其他方法。

 

 

使用方法：

1、染色工作液的配制：

根據樣品數用PBS將DAPI染色液10-100倍稀釋，配制成染色工作液。

【注】：

● 也可使用培養基或其他緩沖液稀釋。

● 原位染色時，也可以不稀釋，直接按合適的終濃度加入培養基混勻。

● 工作濃度應根據不同細胞的預實驗結果確定的最佳工作濃度，建議至少在超時10倍范圍的濃度下進行測試。50倍稀釋適合大多數細胞樣本。

● 檢測貼壁細胞時，胰酶消化前，去掉的上清也要保留，因為可能存在一些掉下來的凋亡細胞，在胰酶消化后，再將這些上清加回去，一起檢測，結果更加準確。

● 離心轉速根據平時該細胞實驗時的轉速即可。

2、細胞爬片/涂片的制備：

貼壁細胞，可將蓋玻片放于培養器皿中，讓培養細胞長于玻片上，然后用藥物誘導細胞凋亡后取出，用4%多聚甲醛固定5min。

【注】：

● 也可其他方式培養后收集細胞制作涂片檢測。

對于懸浮細胞，用藥物誘導細胞凋亡后，500-1000×g離心5分鐘收集細胞，用PBS洗2次，收集調整細胞數為1×10⁵/mL，涂片或用離心涂片，用4%多聚甲醛固定5min；

3、用PBS洗滌涂片兩次。

4、加適量染色工作液于涂片上，室溫避光染色5-30分鐘。

【注】：

● 活細胞原位染色時，不同細胞需要的時間差異較大，一般大部分細胞10-30分鐘即可。有些細胞可能需要較長時間，可將染液加入培養基后避光孵育30分鐘-2小時。

5、吸除染色液。

6、用1×洗滌液洗滌涂片。

【注】：

● 用純水10倍稀釋試劑B，充分混勻，即為1×洗滌液。

7、用熒光顯微鏡檢測結果。

染料-DNA復合物的最大激發波長為360nm，最大發射波長為454nm。

結果分析：

置于熒光顯微鏡下用360nm激發光觀察結果：DAPI染色呈藍白色熒光。

早期凋亡細胞呈現核濃縮，染色加深，或核染色質呈新月形聚集于核膜一邊；晚期凋亡細胞表現為核碎裂成大小不等的圓形小體，并被細胞膜所包繞，即凋亡小體。

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