LDH乳酸脫氫酶檢測試劑盒是利用LDH催化乳酸生成丙酮酸和NADH，NADH通過電子載體將顯色劑還原生成顯色物質，在450nm處的OD值與LDH成正比，利用此原理可以測定死細胞和受損細胞的LDH漏出情況。LDH（乳酸脫氫酶）是存在于細胞質的一種酶，LDH釋放被看做細胞膜完整性的重要指標，并被廣泛用于細胞毒性檢測。當細胞膜受到損傷時...

檢測方法：

● 酶標儀 ● 分光光度計

樣本類型：

● 懸浮細胞 ● 貼壁細胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 酶標儀/分光光度計 ● 離心機 ● 移液器 ● ● PBS緩沖液/HBSS（無酚紅） ● 96孔板

注意事項：

● LDH反應液凍存后溶解時注意重新混勻。

● 冷凍會使樣品中部分乳酸脫氫酶失活。建議樣品準備好后盡量當天完成測定。

● 因為每種細胞的LDH量不同，建議通過預實驗確定高LDH對照和低LDH對照的吸光度差異最大的細胞數。

● 培養基中動物血清中的LDH會增加背景吸收，建議設置一個培養基背景對照來校正。

● 動物血清中的LDH活性較高時，可以通過降低血清濃度來減小其中的LDH造成的背景吸收，一般將血清濃度降低到5%會顯著減小背景。

● 細胞過度生長、密度過高、離心速度過大、培養箱內外溫差過大，都會造成細胞釋放乳酸脫氫酶增加。

● 若需準確計算出漏出的LDH酶活性的絕對活性，請選用其它貨號的試劑盒。

● 不同樣本的LDH漏出情況不一樣，需要做預實驗確定加入LDH反應液后的孵育時間。

● 以下以96孔板培養為例，如果是使用的其它類型的培養板，以實際為準，等比例調整吸入對應規格的試劑即可。

● 因為每種細胞的LDH量不同，為了得到最好的顯色效果，推薦做預實驗確定最佳細胞量。沒條件做細胞數量優化的話，可以選擇較高細胞量實驗。

使用方法：

關于對照孔設置：

● 一般按以下設置對照孔，僅供參考，也可以根據實驗需要自己設置：（例如加入100μL細胞懸液，加入藥物母液1-10μL。）

背景空白對照：保留兩個或三個孔，使其不添加細胞和藥物以用作背景空白對照。

向每個孔中添加110μL新鮮培養基。

待測樣品空白對照：使兩孔或三孔沒有細胞，添加培養基和待測藥物樣品用作樣品空白對照。

加入60μL新鮮培養基+ 50μL待測藥物樣品。

低LDH對照：使兩孔或三孔含有細胞，無添加藥物，用作低LDH對照。

加入60μL新鮮培養基+ 50μL細胞懸液。

高LDH對照：使兩或三孔含有細胞，無添加藥物，加入LDH提取液用作高LDH對照。

加入50μL新鮮培養基+ 50μL細胞懸液+10μL LDH提取液。

高LDH空白對照：使兩孔或三孔不含細胞，無添加藥物，加入LDH提取液用作高LDH空白對照。

加入100μL新鮮培養基+10μL LDH提取液。

表A：

	待測樣品	背景空白對照	待測樣品空白對照	低LDH對照	高LDH對照	高LDH空白對照
培養基	10μL	110μL	60μL	60μL	50μL	100μL
細胞	50μL	-	-	50μL	50μL	-
藥物	50μL	-	50μL	-	-	-
LDH提取液	-	-	-	-	10μL	10μL

LDH測定：

1、吸取50μL用培養基稀釋過的細胞懸液至96孔板中。

【注】：

● 用貼壁細胞時，接種細胞至96孔板過夜預培養，換成新的50μL培養基后，進行操作步驟2。

2、加入50μL含有藥物的培養基（按表A）。

3、在37℃ CO₂培養箱內培養合適的時間。

4、在高LDH對照孔、高LDH空白對照孔中加入10μL LDH提取液后，在樣品、樣品空白、低LDH對照孔和背景空白孔中加入10μL 培養基（按表A），在37℃ CO₂培養箱內培養30-45分鐘。

【注】：

● 加入LDH提取液的孔用移液器輕輕吹打混勻，中間每隔10分鐘用移液器輕輕吹打混勻。

● LDH提取液比較粘稠，容易吸附在吸頭壁，一定要注意有效加入培養基并充分混勻。

● 可以根據樣品數量，按照每50μL培養基+10μL LDH提取液的比例預先多配制一些提取液的工作液，放大體積后提取液的終濃度會更加準確。

● 如果是其它培養體系，LDH提取液按孔中液體量10%加入即可。

5、96孔板離心2 min (250×g)，使懸浮細胞沉淀。

6、從每個孔中吸取100μL上清液至另一個新的96孔板中。

【注】：

● 為了避免吸出細胞，請小心吸取上清液。

7、在新的96孔板每個孔中加入10μL LDH反應液B后，在室溫避光的條件下培養30鐘-4小時。

【注】：

● 培養時間與預實驗在每孔中加入10μL LDH反應液，采用包裹鋁箔等方法避光，在室溫反應一致。

● 一般45分鐘-60分鐘反應時間即可。

● 如果是其它培養體系，LDH反應液按孔中液體量10%加入即可。

8、用酶標儀測定450nm的吸光度。

LDH計算：

計算待測樣品孔-樣品空白孔、高LDH對照孔-高LDH對照空白孔、低LDH對照孔-背景空白孔的吸光度后，算出各種孔的復孔平均值。

細胞損傷率/毒性根據如下公式算出。

細胞損傷率/死亡率/毒性(%) = [(OD_A-OD_C)/(OD_B-OD_C)]×100%

其中：

OD_A：樣品的吸光度(待測樣品孔-樣品空白孔)

OD_B：高LDH對照的吸光度(高LDH對照孔-高LDH對照空白孔)

OD_C：低LDH對照的吸光度(低LDH對照孔-背景空白孔)

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