真菌 酵母尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性光譜法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

 

主要用途

 

真菌/酵母尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP glucose pyrophosphorylase）活性光譜法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）還原后峰值的增高，即采用光譜法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種真菌/酵母細(xì)胞裂解懸液樣品尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶（uridine 5'-diphosphoglucose pyrophosphorylase；UDP glucose pyrophosphorylase；UGPase；EC2.7.7.9），又稱(chēng)三磷酸尿苷葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶（UTP glucose-1-phosphate uridylyltransferase），是碳水化合物代謝中的主要酶蛋白，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞的胞漿里。在真核生物中，其氨基酸序列達(dá)55%同源。尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶主要催化葡萄糖-1-磷酸（glucose-1-phosphate）和三磷酸尿苷（UTP）反應(yīng)產(chǎn)生尿苷二磷酸葡萄糖（UDP glucose）和無(wú)機(jī)焦磷酸（pyrophosphate）的可逆反應(yīng)。其功能在于通過(guò)核糖（nucleotide sugar）的UDP葡萄糖，作為糖苷基供體（glycosyl donor）和各種糖體分子前體（presursor），參與糖原、蔗糖、纖維素、糖脂、糖蛋白、蛋白聚糖以及酵母和植物細(xì)胞壁的生物合成。基于底物尿苷二磷酸葡萄糖和無(wú)機(jī)焦磷酸，通過(guò)尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶（phosphoglucomutase；PGM）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase；G-6-PDH）反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP）轉(zhuǎn)化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADPH）所產(chǎn)生的吸光峰值的變化（340nm 波長(zhǎng)），來(lái)定量分析尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶的活性。尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

裂解液（Reagent A）    毫升

強(qiáng)化液（Reagent B）  毫升

緩沖液（Reagent C）  毫升

底物液（Reagent D）  毫升

反應(yīng)液（Reagent E）    毫升

陰性液（Reagent F）    毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)  1份

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent A）、底物液（Reagent D）和反應(yīng)液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

 

用戶(hù)自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

比色皿或酶標(biāo)板：用于光譜分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于光譜分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent A）置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 

一、 樣品準(zhǔn)備

 

1． 準(zhǔn)備好10毫升待測(cè)的新鮮真菌/酵母細(xì)胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升）

2． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3． 置于冰槽里5分鐘

4． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻

7． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

8． 加入xx微升強(qiáng)化液（Reagent B）

9． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

10． 置于冰槽里1分鐘

11． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟9至10五次

12． 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HL30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

 

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

 

1． 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)7次（共30分鐘），并置零 

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底物液（Reagent D）避免光照

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

三、 背景對(duì)照測(cè)定

 

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升底物液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入xx微升陰性液（Reagent F）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

四、 樣品測(cè)定

 

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升底物液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入20微升待測(cè)樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

 

五、計(jì)算樣品活性

 

六、 酶標(biāo)板測(cè)定

 

1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中的所有孔中

3． 分別加入xx微升底物液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

5． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板

6． 在37℃溫度下孵育3分鐘

7． 分別加入xx微升陰性液（Reagent F）或待測(cè)樣品（20微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）

8． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板

9． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和30分鐘讀數(shù)

10． 活性計(jì)算

 

 

注意事項(xiàng)

 

1． 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（酶標(biāo)板）操作，包括背景對(duì)照

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次

4． 建議使用比色皿測(cè)定

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要 

6． 強(qiáng)化液（Reagent B）為固體狀，移取方法為：使用1毫升槍頭，將部分剪去；或使用0.5毫升PCR管的蓋子內(nèi)圈盛滿(mǎn)；或秤重0.1克

7． 加樣后3秒內(nèi)光譜測(cè)定

8． 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)30分鐘

9． 光譜測(cè)定后，比色皿須清洗徹底

10． 樣本測(cè)定30分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

11． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為20微克/20微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HL30030.1）

12． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

13． 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1微摩爾煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）所需的酶量作為一個(gè)活性單位

14． 本公司提供系列生化酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感