1. 工作原理

辣根過氧化物酶（HRP）由于在辣根中的含量很高，故命名。它的分子量在

40000 左右，在過氧化氫存在時(shí)能催化苯酚、苯胺等聚合，它不會遮蓋抗原的結(jié)

合部位，具有較高活性及特異性，生成的產(chǎn)物不易擴(kuò)散，可作用于多種底物，產(chǎn)

生不同顏色且HRP 穿透力強(qiáng)，易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。DAB 在H2O2 存在的情況下，可

以作為HRP 的電子供體，產(chǎn)生褐色的不溶顆粒，可作為顯色的試劑。

2. 試劑盒組成 (推薦切片數(shù)50～100pcs)

試劑名稱 規(guī)格 備注

5% BSA 15mL 5%BSA 血清封閉液

二 抗 0.1mL HRP 標(biāo)記二抗，根據(jù)需求稀釋成適當(dāng)比例

H2O2 10 mL 3% H 2 O 2 消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性

DAB 顯色液10 mL 已按需求配制成合適濃度

枸櫞酸鹽緩沖液 1Pack 根據(jù)具體需求配制成想要的濃度

3. 操作步驟

3.1. 防脫片劑處理： 可選擇 APES 或Poly-Lysine。撈片后置烤箱30-60 min（設(shè)

定溫度58-60 ℃）以使切片緊密粘附。

3.2. 常規(guī)脫蠟至水： 防脫片劑處理后的切片在二甲苯中脫蠟，將石蠟切片先后

浸入二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ各10min。然后逐級降濃度酒精入水，每次3-5 min。

① 無水酒精 3－5min

② 90% 酒精3－5min

③ 85% 酒精3－5min

④ 75% 酒精3－5min

⑤ 0.01mol/L pH7.4 PBS 洗滌3 次每次 5 min

（以上是本試劑盒推薦酒精梯度）

3.3. 消除內(nèi)源性過氧化物酶：用3% H 2 O 2 室溫孵育 5-10 min，以消除內(nèi)源性

過氧化物酶的活性。PBS 洗滌2-3 次，每次5 min；

3.4. 熱修復(fù)抗原： 將切片置于 0.01mol/L pH6.0 檸檬酸緩沖液，電爐或微波爐

免疫組織化學(xué)(IHC)系列試劑盒

加熱至沸騰后斷電，間隔5-10 min 后，反復(fù)1-2 次，置于室溫自然冷卻。

0.01 mol/L pH7.4 的PBS 洗滌3 次，每次5 min 。

3.5. 封閉： 加封閉液（5%BSA），于濕盒中室溫感作30min，然后甩去多余的

封閉液，不洗；

3.6. 滴加一抗： 滴加適當(dāng)稀釋的一抗到切片上，37℃孵育1小時(shí)左右或者4℃過

夜， 然后0.01 mol/LpH7.4的PBS洗滌3次，每次5 min 。（一抗的稀釋度、

孵育時(shí)間和溫度與染色強(qiáng)度、背景有直接關(guān)系。一般來說，陽性染色強(qiáng)度

不夠時(shí)，可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時(shí)間；背景過高時(shí)，可降低一抗?jié)舛?/div>