志賀氏菌熒光 PCR 檢測試劑盒說明書
1、 試劑盒簡介
貨號(hào)：HB-1131-1
志賀氏菌屬(Shigella)即通稱的痢疾桿菌，為革蘭氏陰性菌。志賀氏菌傳染源主要為病人和帶菌
者,通過污染了痢疾桿菌的食物、飲水等經(jīng)口感染，是人類細(xì)菌性痢疾為常見的病原菌。
為了適應(yīng)志賀氏菌快速檢測和疫病研究的需要，本公司參考 2007 年質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局
發(fā)布的中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 1870-2007）《食品中致病菌檢測方法-實(shí)時(shí)
PCR 法》中規(guī)定的引物和探針序列，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)及系統(tǒng)優(yōu)化，開發(fā)生產(chǎn)了本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒
進(jìn)行檢測具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、安全操作簡單、應(yīng)用廣泛和高通量檢測等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。
2、試劑盒組成
試劑盒具體組成如下（50 test/盒）：
組成成分 體積
DEPC 水
志賀氏菌熒光 PCR 反應(yīng)液
Taq 酶(5 U/uL)
陰性對(duì)照
志賀氏菌熒光陽性對(duì)照
5 mL×1 管
800 μL×1 管
30 μL×1 管
1 mL×1 管
1 mL×1 管
*保存條件：試劑盒須在-20℃保存。
3、樣本采集，存放及運(yùn)輸
3.1 樣本采集：無菌稱取樣品25 g，加入裝有225 mL志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)杯中，8,000 r/min均質(zhì)
1 min，42℃厭氧培養(yǎng)16-20 h。取培養(yǎng)好的細(xì)菌涂于MAC瓊脂平板，37℃培養(yǎng)20~24 h，取長出的
菌落接種于增菌培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20~24 h備用。
3.2存放：樣本在2 ℃-8 ℃條件下保存應(yīng)不超過24 h；加入15%-20%甘油可于-70 ℃以下長期保存。
3.3 運(yùn)輸：密封運(yùn)輸，嚴(yán)防泄露污染。
4、檢測步驟
4.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進(jìn)行)：
4.1.1 待檢樣品增菌處理后，取 n 個(gè) 1.5 mL 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數(shù)、一管陽性對(duì)照
和一管陰性對(duì)照之和，對(duì)每個(gè)管進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記，加入對(duì)應(yīng)樣品 1 mL；
4.1.2 于 8,000 r/min 離心 5 min，去上清；
4.1.3 加入滅菌生理鹽水洗滌 2 次，后用 1 mL 滅菌生理鹽水懸浮；
4.1.4 將樣品于置于 100℃干浴或沸水浴 5 min，12,000 r/min 離心 5 min，
4.1.5 吸取上清，即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或放置
于-70℃冰箱內(nèi)保存）。
注：細(xì)菌核酸提取可選配細(xì)菌 DNA 柱式提取試劑盒（貨號(hào)：SK-CE-1），效果更好。
4.2 熒光 PCR 檢測
4.2.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：
從試劑盒中取出相應(yīng)的熒光 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶，2,000 g 離心 5 s。每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系配
制見下表。
試劑 熒光 PCR 反應(yīng)液 Taq 酶 合計(jì)
用量 14.5 μL 0.5 μL 15 μL
4.2.2 加樣（樣本處理區(qū)進(jìn)行）：
向每個(gè)熒光PCR管孔中各分裝15 μL的混合液，再分別加入樣本DNA模板10μL，蓋緊管蓋，
500 r/min 離心 30 s。
4.2.3 PCR 檢測（在檢測區(qū)進(jìn)行）：
循環(huán)條件設(shè)置：一階段，95℃/3 min；
第二階段，95℃/5 sec，60 ℃/40 sec，40個(gè)循環(huán)，在第二階段每次循環(huán)的退火延伸時(shí)
收集FAM熒光。試驗(yàn)檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。
5、結(jié)果判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣
品擴(kuò)增曲線的zui高點(diǎn)為準(zhǔn)。
5.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性對(duì)照無擴(kuò)增曲線、無 Ct 值或Ct 值≥40。
陽性對(duì)照的 Ct 值應(yīng)<30，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無效。
5.3 結(jié)果描述及判定
陰性: 陰性對(duì)照無擴(kuò)增曲線、無 Ct 值或Ct 值≥40，示樣品中無志賀氏菌。
陽性: Ct值≤35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，示樣品中存在志賀氏菌。
有效原則:40＞Ct>35的樣本建議重做。
6、相關(guān)技術(shù)信息
F：5’-CGCAATACCTCCGGATTCC-3’
R：5’-TCCGCAGAGGCACTGAGTT-3’
PROBE: 5’-FAM-AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA-TAMRA-3’