一站式miRNA尿素-PAGE電泳套裝說明書

產品編號：BTN70606

規格：30T

產品及特點：

尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Urea PAGE)是目前分離200 nt以下的小片段RNA，尤其是20 nt左右的microRNA(miRNA)分子的主要方法，但是單獨配制各種溶液十分繁瑣，為此我們公司開發了本產品。它具有下列特點:

1. 一站式，含有電泳所需要的所有試劑，即開即用，十分方便，免去了實驗人員稱取有毒物品。

2. 靈活，可以根據需要配制各種濃度的Urea-PAGE，以便對長度各異的RNA進行電泳。

3. 電泳后可直接用于UV觀察、銀染、膠回收、Northern雜交和放射自顯影等。

4. 使用緩沖液，可以防止甘油的干擾。

規格及成分：

保存條件：

常溫運輸、4℃保存（miRNAon、miRNA Marker需要-20°C保存）。保存期為一年。

自備試劑：

miRNA樣品、RNase-free水。

使用方法：

1. 準備工作：用固相RNase清除劑清潔工作平臺直接將固相RNase清除劑原液或10倍的新鮮稀釋液噴于臺面，5分鐘后用普通吸水紙擦凈，zui后用沾有固相RNase清除劑1000倍新鮮稀釋液的吸水紙擦凈，晾干。

2. 準備工作：用固相RNase清除劑清潔玻璃和塑料器皿將器皿浸泡在固相RNase清除劑的10或100倍的新鮮稀釋液中，靜置處理5分鐘后取出，再用固相RNase清除劑1000倍或10000倍新鮮稀釋液浸泡二次以上，倒立晾干后備用。

3. 配制1×TBE電泳液: 將適量的10×TEB電泳液用RNase-free水稀釋10倍，得到1×TBE電泳液待用。此溶液需要現用現配，否則易長菌。

4. 配制10%過硫酸銨溶液: 準確稱取約100 mg過硫酸銨到一干凈的1.5mL離心管中，按每 1 mg 過硫酸銨加10μL RNase-free水的比例加入RNase-free水，搖晃溶解待用。10%過硫酸銨溶液有效期不要超過一周。

5. 估計所需要的凝膠溶液的體積，一般配制一塊13cm×15cm×0.8mm的膠需要15mL凝膠溶液，配制一塊36cm×45cm×0.8mm的膠需要120mL凝膠溶液。

6. 配制 40%的丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液：將 3g 甲叉雙丙烯酰胺加入到裝有60g丙烯酰胺干粉的瓶中，再加入130 mL RNase-free水，充分搖晃混勻即得40%的Acrylamide/Bis溶液。

7. 根據所需要的凝膠溶液的體積，在一的干凈的三角瓶中按下表加入各成分（此處以配制100mL Acrylamide/Bis終濃度為15%的凝膠為例）:

注: Acrylamide/Bis的終濃度需要根據待分離RNA長度選擇(見下表)。

8. 攪拌并加熱到40-50℃左右，直到尿素完全溶解。

9. 冷卻到室溫后，將三角瓶接上真空系統抽真空處理10-15分鐘以充分去除溶液中的氧氣（氧氣會降低聚合反應效率）。若條件有限，此步可省略。

10. 邊搖晃溶液變加入50μL TEMED和 500μL 10%過硫酸銨。注意：如果選擇其他工作濃度的 Acrylamide/Bis，此二成分的用量不需要隨之改變。

但如果配置的凝膠溶液的體積變化，此二成分的用量要按比例改變。

11. 再充分搖晃約 30 秒后迅速灌膠，然后插入樣品梳，室溫放置 30-60 分鐘等待膠凝固。

12. 將凝膠板放置在電泳裝置上后，在上下層分別加入適當量的 1×電泳緩沖液。如果不馬上使用，需要有濕紙將上樣孔端蓋住以防凝膠過度干燥。

13. 拔出梳子后用加樣槍吸取電泳緩沖液，充分將每個加樣空中未聚合的Acrylamide/Bis、尿素和氣泡吹打出來。

14. 在上樣前，預電泳20-30分鐘以使多余的過硫酸銨跑出加樣空，同時還可以使凝膠的溫度升高（到 50℃左右），有利于 RNA 變性狀態。

15. 將 miRNA 樣品與等體積的miRNAon混合，70℃保溫 2-3分鐘后迅速放置在冰上冷卻，快速離心半分鐘，放冰上待用。miRNA Marker 需要每個上樣孔用 5μL，一塊膠zui好在兩側各用一個孔上樣miRNA Marker。

16. 關電泳儀后開始上樣。

17. 重開電泳儀，對13 cm×15 cm的膠，以20-30mA的電流電泳，直到紅色染料移動到凝膠邊緣為止；對36cm×45cm的膠，則以50-60mA的電流電泳，直到紅色染料移動到凝膠邊緣為止。

18. 染色觀察：將凝膠一面的玻璃板揭開，直接用仍然附著在另一玻璃板上的凝膠進行各種染色，包括銀染（固定、漂洗、顯影和定影等步驟）、EB（每100mL 1×TBE中加20μL 10mg/mL 的EB溶液）、天澤基因低毒核酸染料DNAgreen（每100 mL 1×TBE 中加10μL DNAgreen原液）。UV下觀察并拍照。

19. miRNA回收：按上法用EB等染料染色后，UV下確定所需要的miRNA條帶的位置，切膠后進行膠回收處理。

20. Northern 雜交：按上法用EB等染料染色后，UV下確定所需要的miRNA條帶的位置，切膠后電轉移到帶正電的尼龍膜上，然后進行雜交處理。

21. 放射自顯影：如果miRNA樣品電泳前經過同位素標記，則將凝膠一面的玻璃板揭開，用濾紙將附著在另一玻璃板上的凝膠吸附過來，然后包上保鮮膜，真空抽干，然后使膠跟X光片向對置進行放射自顯影。