分枝桿菌DNA提取試劑盒說明書

產品編號：BTN70702

規格：50T

產品及特點：

分枝桿菌屬（Mycobacterium）是為古老的細菌，與人類的疾病相關的就有25種以上，包括引起結核病的結核分枝桿菌（Mycobacteria tubercμLosis）。近年來由于多重耐藥性分枝桿菌的出現，分枝桿菌再次成為人們關心的細菌。PCR快速診斷是目前檢測分枝桿菌的主流方法，但由于此類細菌具有十分獨特的堅硬的細胞壁，快速提取其基因組DNA一直是十分棘手的技術問題。本產品就是為解決這一問題而開發，具有下列特點：

1. 每克分枝桿菌濕重可以提取到3-4mg基因組DNA。

2. 操作簡單，整個過程約60分鐘左右，容易放量操作。

3. 適用于培養的分枝桿菌，也適用于含分枝桿菌的痰液等樣品。

4. 價廉物美，與國外同類產品相比質量相當，但價格。

規格及成分：

保存條件：

常溫運輸及保存、有效期一年。

自備試劑：

氯fang、70%乙醇、無水乙醇。

使用方法：

注意：文獻報道部分分枝桿菌在DNA提取過程中還有形成菌落的能力，所以任何丟棄的溶液都必須按有傳染性的污染物品對待，并嚴格按有關部門要求進行消毒處理。

一: 如果細菌來于痰液樣品，則按下面方法進行預處理（本試劑盒不提供所需試劑，操作步驟僅供參考）

1. 用痰液收集器收集約5mL患者深咳痰并轉移到15mL塑料離心管中。

2. 加入等量的化痰液（2% NaOH、1.45%檸檬酸鈉、0.5% N-乙酰-L-半胱氨酸），震蕩使二者充分混勻。37℃放置25-40分鐘。此步處理可以使粘稠的痰液便于操作，同時可以裂解不屬于分枝桿菌的雜菌，只有分枝桿菌保持完整。

3. 5000 g離心5分鐘，棄上清液。分枝桿菌將沉淀在管底，可以直接用于DNA提取。也可以保存在-20℃待用。

二: 如果分枝桿菌來于培養的菌落，則按下面方法進行預處理

1. 刮取培養的菌苔到1 mL TE緩沖液中（裝在1.5mL塑料離心管中）并充分震蕩使細菌均勻重懸。如果是培養的液體菌液或其他液體樣品材料，則取1mL菌液到1.5 mL塑料離心管中。一次提取所需zui佳細菌用量為10⁹ CFU左右。

2. 80℃加熱20分鐘殺滅分枝桿菌使之失去傳染性。

4. 常溫5000 g離心5分鐘，棄上清液。分枝桿菌將沉淀在管底，可以直接用于DNA提取。也可以保存在-20℃待用。

三: 分枝桿菌基因組DNA提取

1. 將150μL 65℃預熱過的溶液A加到上步得到的、有分枝桿菌沉淀的塑料離心管中，充分震蕩使細菌均勻懸浮。

2. 再加入300μL溶液B（呈乳濁狀）和300μL自備氯fang，充分震蕩混勻。

3. 將混合液-20℃放置直到液體凝固，一般需要20-60分鐘。一定要凝固后才能進入下一步。

4. 將樣品管放室溫融化后，12000-15000g室溫離心5分鐘，小心轉移上清到一新的離心管中。

5. 在上清液中加兩倍體積的無水乙醇，顛倒混勻后12000-15000g室溫離心10分鐘，小心棄上清。DNA將形成沉淀，不要丟失。

6. 在離心管中加1mL自備70%乙醇，短暫震蕩，12000-15000 g室溫離心3分鐘，棄上清。此步洗滌殘留鹽離子等雜質。

7. 重復上述操作一次。

8. 短暫離心離心管，小心吸棄殘留的液體（約50μL）。此步不要省略，否則殘留的液體（含乙醇）將會影響DNA電泳、酶切和PCR等反應。

9. 立即加入50-100μL TE緩沖液充分溶解DNA沉淀。

10. 直接取5-10μL電泳檢測DNA，其余放冰箱備用或用于后續反應。