組織沉默調節蛋白 3 （SIRT3）活性熒光定量檢測試劑盒（中文版）
主要用途
組織沉默調節蛋白 3 （SIRT3）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針氨甲基香豆su標記人工合成的乙酰化 p53 多肽底物，經過 SIRT3 脫乙酰基后，被位點特異性氨基肽酶水解，釋放釋放出具有強烈熒 光的 7-氨-4 甲基香豆su，即采用熒光法來測定組織裂解萃取樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技 術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、線粒體蛋白樣品、 部分或完全純化酶樣品中 SIRT3 的活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用， 操作簡捷，性能穩定。
技術背景
人體組蛋白脫乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家屬分成三類共20多個蛋白：種類I（class I）與酵母 Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于細胞核中；種類II（class II）與酵母Hda1蛋白同源，包括 HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于細胞核和細胞漿里；上述兩大種類的蛋白分子催化 結構域含有鋅，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。種類III（class III）為NAD+輔助因子必需，又稱為sirtuins，與酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，是進化保留的古老的酶類，存在于真核生 物、古生菌（Archaea）和真細菌（Eubacteria）等，包括SIRT1至7等，為曲古菌素A（trichostatin A；TSA） 不敏感型賴氨酸脫乙酰基酶（lysyl-deacetylase）。催化賴氨酸脫乙酰基反應，以及由NAD+和乙酰（acetyl） 基團轉化產生的煙酰胺（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。其中可溶性SIRT3位于 細胞線粒體內，體內熱量限制（caloric restriction）、寒冷刺激、細胞應激等因素，使成熟且活性Sirt3由細胞 核轉移到線粒體，經基質加工肽酶（matrix-processing peptidase）激活，表達增加，作用于乙酰輔酶A合酶2 （acetyl CoA synthetase 2）、UCP1、PGC-1α等天然目標底物，脫乙酰化和激活。其功能在于調節適應性生 熱反應（thermogenesis）、確保能量產生、提供乙酸的代謝使用、調節基礎ATP水平、調節影響線粒體通透 性的凋亡信號、調節表觀遺傳基因沉默，是代謝或氧化狀態的感應因子，生命延長（life extension）的標志。 Sirt3異常，將導致神經退行性疾病、癌癥、衰老、代謝功能異常等疾病。基于人工合成的乙酰化p53多肽底 物Ac- Gln-Pro -Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切離的功能，先使用熒光染料氨甲基香豆su（aminomethylcoumarin；AMC）來標記乙酰化p53多肽底物，其次進行脫乙酰化，Z后底物進一步在氨基肽酶的催化酶解，釋放出具有強烈熒光的7-氨-4甲基香豆su（7-amino-4-methylcoumarin；AMC）（激發波長350-360nm；散發波長450-465nm），由此來定量測定沉默調節蛋白3的活性。其反應系統為：
產品內容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
底物液（Reagent D） 微升
終止液（Reagent E） 微升
酶解液（Reagent F） 微升
補充液（Reagent G） 微升
標準液（Reagent H） 微升2
產品說明書 1 份
保存方式
保存緩沖液（Reagent C）、底物液（Reagent D）、終止液（Reagent E）、酶解液（Reagent F）和標準液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在 4℃冰箱里；底物液（Reagent D）和標準液（Reagent H）避免光照，有效保證 6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器
15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
5 毫升 DOUNCE 勻漿器：用于裂解細胞
（微型）臺式離心機：用于細胞預處理
培養箱：用于反應物孵育
黑色 96 孔板或 100 微升 1 厘米光徑比色皿：用于反應和熒光分析的容器
熒光酶標儀或熒光分光光度儀：用于熒光分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。
一、樣品準備（線粒體蛋白）
1． 手術取出動物組織，并秤重以確定 500 毫克組織重量
2． （選擇步驟）放進預冷的 15 毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入 xx 毫升清理液（Reagent A）清洗 1 次
4． 加入 xx 毫升裂解液（Reagent B）
5． 移入到預冷的 5 毫升 DOUNCE 勻漿器
6． 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約 20 至 40 下）
7． 將所有細胞勻漿物移入 1.5 毫升離心管
8． 放進 4℃微型臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 1500g
9． 小心移出上清液到另一個新的預冷的 1.5 毫升離心管
10．放進 4℃微型臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 10000g
11．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒
12．加入 xx 微升裂解液（Reagent B），充分混勻
13．移取 10 微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
14．即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
二、 測定準備
1． 準備好待測樣品（例如線粒體蛋白或純化酶樣品等），置于冰槽里
2． 設定好熒光酶標儀或熒光分光光度儀（溫度為 30℃）：激發波長 350-360nm；散發波長 450-465nm
3． 緩沖液（Reagent C）置于室溫下均衡溫度
4． 準備好 5 個 1.5 毫升離心管，標記為 1 至 5 號管3
5． 分別加入 xx 微升緩沖液（Reagent C）到 1 至 5 號管
6． 移取 xx 微升標準液（Reagent H）到 1 號管，混勻
7． 小心移取 xx 微升 1 號管稀釋的標準液（Reagent H）到 2 號管，混勻
8． 小心移取 xx 微升 2 號管稀釋的標準液（Reagent H）到 3 號管，混勻
9． 小心移取 xx 微升 3 號管稀釋的標準液（Reagent H）到 4 號管，混勻
10．將 1 至 5 號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表
管號 緩沖液（Reagent C） 標準液（Reagent H） 標準氨甲基香豆su濃度
1 xx 微升 xx 微升 xx 微摩爾/升
2 xx 微升 xx 微升 1 號管 xx 微摩爾/升
3 xx 微升 xx 微升 2 號管 xx 微摩爾/升
4 xx 微升 xx 微升 3 號管 xx 微摩爾/升
5 xx 微升 0 0
三、標準測定
1． 在黑色 96 孔板上做好相應標記：標準樣品 1 至 5 管
2． 分別移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到相應孔里
3． 分別加入 xx 微升上述配制的標準液（Reagent H）
4． 輕輕搖動黑色 96 孔板 30 秒
5． 即刻放進熒光酶標儀或轉移到 100 微升比色皿，在熒光分光光度儀里檢測：獲得相對熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）讀數
6． 構建標準曲線：縱座標（Y 軸）為相對熒光單位（RFU）；橫座標（X 軸）為標準氨甲基香豆su濃度（微 摩爾/升）
四、活性測定
1． 在黑色 96 孔板上做好相應標記：背景空對照和待測樣品
2． 分別移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到相應孔里
3． 分別加入 xx 微升底物液（Reagent D）
4． 分別加入 xx 微升補充液（Reagent G）或待測樣品（50 微克線粒體蛋白或 200 微克細胞裂解萃取液總 蛋白）（注意：樣品須清澈）
5． 輕輕搖動黑色 96 孔板 30 秒
6． 放進 30℃培養箱里，孵育 60 分鐘，避免光照
7． 分別加入 xx 微升終止液（Reagent E）
8． 分別加入 xx 微升酶解液（Reagent F）
9． 輕輕搖動黑色 96 孔板 30 秒
10．在 30℃培養箱里，孵育 30 分鐘
11．即刻放進熒光酶標儀或轉移到 100 微升 1 厘米光徑比色皿，在熒光分光光度儀里檢測：獲得相對熒光 單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）讀數
12．根據標準曲線獲得樣品對應氨甲基香豆su濃度（微摩爾/升）
四、 計算樣品活性
方法一：RFU 直接法4
根據樣品的熒光讀數 RFU 作為樣品酶活性單位
方法二：標準氨甲基香豆su濃度測算法
注意事項
1． 本產品為 20 次操作
2． 操作時，須戴手套
3． 系統操作過程中，標準測定只需 1 次
4． 注意增益倍數的設置
5． 樣品須澄清，至關重要
6． 樣品處理時，避免使用蛋白酶抑制劑、PMSF、烷基胺（alkyl amine）等
7． 孵育反應完成后即刻進行熒光測定
8． 測定值由低到高變化；測定持續 60 分鐘
9． 測定值熒光讀數越高，表明酶活性越高
10．熒光測定后，比色皿須清洗徹底
11．待測樣本為線粒體蛋白樣品，其蛋白濃度為 50 微克/20 微升；待測樣本為細胞裂解懸液，其蛋白濃度為 200 微克/20 微升（本公司提供 Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒 GMS30030.1）
12．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
13．樣品活性計算根據用戶要求，選擇直接法或測算法；如果選擇直接法，可以不必測定標準樣品
14．沉默調節蛋白 3 單位活性定義為：在 30℃，pH 8.0 條件下，每分鐘內能夠釋放 1 納摩爾氨甲基香豆su所需的酶量作為一個活性單位
15．本公司提供系列組蛋白脫乙酰基酶檢測試劑產品
質量標準
1． 本產品經鑒定性能穩定
2． 本產品經鑒定檢測敏感
使用承諾
秉著“信譽至上、客戶滿意、質量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優質產品和服務。用戶收到貨后，應按照產品說明書上的規定妥善保管并在有效期內使用。我們的產品在銷售前已作嚴格的質量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后 10 天內若發現確屬本產品的質量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司聯系，并將該產品退回，經檢驗確系產品質量所致，本公司負責更換產品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔由此造成的損失。
友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。
訂購信息5
單組分訂購信息
編號 名稱 規格
GMS50290.2 組織沉默調節蛋白 3（SIRT3）活性熒光定量檢測試劑盒 20 次
GMS50290.2A 清理液（Reagent A） 毫升
GMS50290.2B 裂解液（Reagent B） 毫升
GMS50290.2C 緩沖液（Reagent C） 毫升
GMS50290.2D 底物液（Reagent D） 微升
GMS50290.2E 終止液（Reagent E） 毫升
GMS50290.2F 酶解液（Reagent F） 毫升
GMS50290.2G 補充液（Reagent G） 毫升
GMS50290.2H 標準液（Reagent H） 微升
試劑盒訂購信息
產品編號 名稱 規格
GMS50287.1 細胞沉默調節蛋白 1 （SIRT1）活性比色法定量檢測試劑盒 20 次
GMS50287.2 組織沉默調節蛋白 1 （SIRT1）活性比色法定量檢測試劑盒 20 次
GMS50288.1 細胞沉默調節蛋白 3（SIRT3）活性比色法定量檢測試劑盒 20 次
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GMS50290.2 組織沉默調節蛋白 3（SIRT3）活性熒光定量檢測試劑盒 20 次
