細胞內氧化應激活性氧超氧陰離子MitoSOX紅色熒光測定試劑盒產品說明書
 
主要用途
 
細胞內氧化應激活性氧超氧陰離子MitoSOX紅色熒光測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑MitoSOX，在線粒體氧化損傷條件下，產生紅色熒光，來檢測細胞內超氧陰離子活性氧族的生成和增加的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老、代謝和營養學等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩定。
 
技術背景
 
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。其中線粒體氧化磷酸化副產物之一是超氧陰離子，為線粒體內主要的活性氧族，與心血管疾病，包括高血壓、冠狀動脈硬化、糖尿病相關的血管疾病、神經退行性疾病（巴金森氏癥、阿茨罕默癥、肌萎縮硬化癥）相關。MitoSOX是一種完全自由通過細胞膜，并選擇性在活體細胞線粒體內長期滯留而不外漏的染色劑。一旦被超氧自由基陰離子氧化，便產生熒光。據此證明細胞線粒體內超氧陰離子活性氧族的存在。
 
產品內容
 
清理液（Reagent A）    毫升
染色液（Reagent B）    微升
稀釋液（Reagent C）    毫升
保存液（Reagent D）    毫升
產品說明書    1份
 
保存方式
 
保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
 
用戶自備
 
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HL12024）：用于細胞脫離
完全細胞培養液（HL12052）：用于細胞操作所需的培養基
15毫升錐形離心管：用于細胞操作的容器
1.5毫升離心管：用于細胞染色的容器
培養箱：用于反應孵育
血細胞計數儀：用于細胞計數
臺式離心機：用于樣品操作
比色皿或96孔板：用于熒光定量分析的容器
細胞流式儀：用于細胞熒光分析
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察熒光細胞
熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于細胞熒光定量分析
 
實驗步驟
 
?間接法
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent C），混勻后，標記為染色工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。
 
?準備1瓶25cm2細胞培養瓶的待測細胞
?小心抽去細胞培養液
?加入xx毫升 清理液（Reagent A）到細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面
?小心抽去清理液（Reagent A）
?加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養平面
?置入37℃培養箱1分種
?振動培養瓶，使細胞脫落
?加入4毫升用戶自備的完全細胞培養液
?移入15毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細胞直接從這一步驟開始）
?移取10微升在血細胞計數儀上進行細胞計數
?移出1 X 106細胞到新的15毫升錐形離心管
?放入臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
?小心抽去上清液
?加入xx毫升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液，輕柔混勻
?放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
?放入臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
?小心抽去上清液
?加入預冷的xx微升保存液（Reagent D），輕柔混勻細胞顆粒群
?放進冰槽里
?選擇下列方式之一進行操作：
?即刻進行細胞流式儀分析：藻紅蛋白（phycoerythrin；PE）波段，觀察50000個細胞以上――
波峰右移，表明超氧陰離子含量高
 
?或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：
1）移取10微升上述細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片
2）激發波長510nm，散發波長580nm――
紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高
 
?或使用熒光分光光度儀或熒光酶標儀檢測（定量檢測）：
1）移取400微升上述細胞懸液到1毫升比色皿
2）加入xx微升保存液（Reagent D）
3）上下傾倒混勻數次
4）放進熒光分光光度儀：激發波長510nm，散發波長580nm――
RFU增高，表明超氧陰離子含量高
 
?直接法
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent C），混勻后，標記為染色工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。
 
1．準備1個細胞培養24孔板的待測細胞，細胞鋪滿率達70％
（注意：可以使用載玻片，載玻片培養皿，35mm培養皿，和其它培養孔板，見注意事項5）
2．小心抽去細胞培養液
3．小心沿著孔壁加入xx微升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的
染色工作液到1個細胞培養孔，覆蓋培養孔表面
4．放進37℃細胞培養箱里孵育20分鐘
5．小心抽去含有染色工作液 
6．小心沿著孔壁加入xx微升37℃預熱的保存液（Reagent D）到細胞培養孔
7．選擇下列方式之一進行操作：
（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：
激發波長510nm，散發波長580nm――紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高
 
?使用熒光分光光度儀或熒光酶標儀檢測（定量檢測）：
放進熒光分光光度儀或熒光酶標儀：激發波長510nm，散發波長580nm――RFU增高，表明超氧陰離子含量高
 
注意事項
 
?本產品為20次（1毫升體系）或40次（0.5毫升體系）操作
?操作時，須戴手套
?孵育時，避免光照
?本產品適合各種規格的培養細胞：載玻片，載玻片培養皿，35mm培養皿，和各種培養孔板，須相應調整操作用量：
 
操作容器 操作用量
載玻片 100微升
載玻片培養皿 1毫升
35mm培養皿 1毫升
96孔培養板 100微升
48孔培養板 200微升
24孔培養板 500微升
12孔培養板 1毫升
6孔培養板 2毫升
25cm2細胞培養瓶 3毫升
 
?根據細胞類型，調整染色工作液使用劑量（1：200至1：1000容量比），避免過度染色
?建議細胞染色完成后，即刻進行細胞熒光分析
?本公司同時提供系列超氧陰離子活性氧檢測試劑產品
 
質量標準
 
?本產品經鑒定性能穩定
本產品經鑒定熒光清晰