1 葉綠素含量測定：
80％的丙酮液的配制：4L丙酮 + 1L蒸餾水。
稱0.5g左右的葉片放在50ml的離心管（做三個重復），加入25ml濃度為80％的丙酮液，放在黑暗處浸提大約36小時后取出，稀釋4倍后分別在波長663nm、645nm、652nm和470nm下測定光密度，以80％的丙酮液為空白。（參考陳建勛，王曉峰主編的《植物生理學實驗指導》,P35～36）
也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm處有zui大吸收峰
Ca=13.95D665-6.88D649
Cb=24.96D649-7.32D665
Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245
2 抗氧化酶活性的定：（2.5g樣）
0.05mol/L磷酸緩沖溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L。（參考陳建勛，王曉峰主編的《植物生理學實驗指導》，P134）。
取低溫保存的鮮樣，稱2g左右的葉片（或根）放在50ml的離心管，加入20ml濃度為0.05mol/L磷酸緩沖溶液（pH=7.8）（是較冷的磷酸緩沖溶液，防止研磨時溫度過高使酶失活），研磨（用磨碎機磨），8000r/min的冷凍離心機下離心20分鐘，上清液為粗酶液。
2.1丙二醛（MDA）的測定：
20％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：稱200g三氯乙酸，用蒸餾水定容到1000ml。（參考陳建勛，王曉峰主編的《植物生理學實驗指導》,P124）；
0.5% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：稱5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20％三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。（參考陳建勛，王曉峰主編的《植物生理學實驗指導》,P124）（先加少量的氫氧化鈉1mol/L溶解）；
0.5ml酶液（對照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸緩沖液代替酶液）（做三個重復）+ 3mlTBA――振蕩――沸水浴上反應30min――冷卻（至少30min）――比色（OD600、OD532、OD450）。（參考陳建勛，王曉峰主編的《植物生理學實驗指導》，P124）
2.2超氧化物歧化酶（SOD）的測定：
NBT(400ml)混合反應液:
392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸銨+8ml核黃素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液
（100mlPBS緩沖溶液中含0.01204g核黃素）。
（另配）100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na
測試時：取3ml反應液+0.05ml(根)或0.02 ml(葉)粗酶液，于光照培養箱中6-10分鐘，OD650下測定吸光度。
2.3過氧化物酶（POD）的測定：
0.05mol/L磷酸緩沖溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。
0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸緩沖溶液(PBS)定容到250ml。
0.2%愈創木酚溶液的配制：稱0.5g愈創木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸緩沖溶液(PBS)定容到250ml。
2ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈創木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸緩沖溶液(PBS) + 0.02ml？？（原來為0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（對照用0.05mol/L磷酸緩沖溶液代替酶液）（做三個重復），記錄470nm處OD降低速度。將每分鐘OD增加0.01定義為1個活力單位。（參考陳建勛，王曉峰主編的《植物生理學實驗指導》P121）
比色時加酶液，混合后即刻計時。
2.4 脯氨酸的測定
標準曲線的制作：
|
編號 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
標準脯氨酸的量（ml） |
0 |
0.1 |
0.2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
1.0 |
|
H2O（ml） |
1.0 |
0.9 |
0.8 |
0.6 |
0.4 |
0.2 |
0 |
|
冰乙酸（ml） |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
|
顯色液（ml） |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
|
脯氨酸含量（µl） |
0 |
1 |
2 |
4 |
6 |
8 |
10 |
0.5ml酶液（對照用0.5ml 80％乙醇代替）（做三個重復） + 1ml冰乙酸 + 1.5ml顯色液―――混勻，沸水浴15min，冷卻后測OD520。
2.5可溶性蛋白的測定（參考趙志杰，史國安，董新純編的《植物生理學實驗指導》）
牛血清白蛋白：配成100µg/ml和1000µg/ml。
90％乙醇：90ml乙醇 + 10ml蒸餾水。？？？
85％（W/V）磷酸：170ml磷酸 + 30ml蒸餾水。
考馬斯亮藍G-250:稱0.2g考馬斯亮藍G-250溶于100ml 90％乙醇中，加入85％（W/V）磷酸200ml，用蒸餾水定容到2L。常溫下可保存一個月。
標準曲線的制作：
配制0～100µg/ml血清白蛋白血液
|
管號 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
100µg/ml牛血清白蛋白(ml) |
0 |
0.2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
1.0 |
|
蒸餾水量(ml) |
1.0 |
0.8 |
0.6 |
0.4 |
0.2 |
0 |
|
蛋白質含量（ml） |
0 |
0.02 |
0.04 |
0.06 |
0.08 |
0.10 |
配制0～1000µg/ml血清白蛋白血液
|
管號 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
100µg/ml牛血清白蛋白(ml) |
0 |
0.2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
1.0 |
|
蒸餾水量(ml) |
1.0 |
0.8 |
0.6 |
0.4 |
0.2 |
0 |
|
蛋白質含量（ml） |
0 |
0.2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
1.0 |
0.1ml 酶液（做三個重復） + 5ml考馬斯亮藍G-250―――混勻，放置2min后在595nm下比色。
2.6過氧化氫酶（CAT）的測定：
0.3%H2O2溶液的配制：吸5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸緩沖溶液(PBS)定容到500ml。
1 ml 0.3%H2O2溶液 + 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液，測定240nm處OD降低速度。將每分鐘OD減少0.01定義為1個活力單位。（參考陳建勛，王曉峰主編的《植物生理學實驗指導》P121）
2.7 抗壞血酸（ASA）的測定：（參考陳建勛，王曉峰主編的《植物生理學實驗指導》,P125）
5％ 三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g三氯乙酸，用蒸餾水定容到500ml。
10％ 三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g三氯乙酸，用蒸餾水定容到250ml。
150mmol/L NaH2PO4（pH 7.4）溶液的配制：100ml。
44％ H3PO4溶液的配制：250ml。
4％ 2,2-二聯吡啶溶液的配制：250ml。
3％ FeCl3溶液的配制：100ml。
先標制作準曲線。
粗酶液的提取：取低溫保存的鮮樣，稱0.5g左右的葉片（或根）放在50ml的離心管，加入15m 5％三氯乙酸（TCA）溶液（是較冷的三氯乙酸（TCA）溶液，防止研磨時溫度過高使酶失活），研磨（用磨碎機磨），15000r/min的冷凍離心機下離心10分鐘，上清液為粗酶液，用于抗壞血酸（ASA）含量的測定。（參考陳建勛，王曉峰主編的《植物生理學實驗指導》P125～126）
測定：0.2ml 粗酶液 + 0.2ml 150mmol/L NaH2PO4（pH 7.4）溶液 + 0.2ml H2O，混勻（振蕩），至少30秒后，再依次分別加入：0.4 ml 10％三氯乙酸（TCA）溶液 + 0.4 ml 44％ H3PO4溶液 + 0.4 ml 4％ 2,2-二聯吡啶溶液 + 0.2ml 3％ FeCl3溶液，混合后在37℃水浴中保溫60min，測定OD525處的值。（參考陳建勛，王曉峰主編的《植物生理學實驗指導》P125～126）
2.8 谷胱甘肽的測定：
4g新鮮材料 + 2ml 0.3mol/L醋酸汞 + 2ml 30％醋酸鈉后研磨勻漿，轉移到離心管中，以蒸餾水沖洗殘渣，并以玻璃棒攪拌，凈置10min，使之充分沉淀，離心后棄去上清液，沉淀以水（每次10ml）在搖動情況下沖洗2次。向沉淀中加入10ml 1mol/L鹽酸以溶解其中的谷胱甘肽，以玻璃棒攪拌5min后加入1ml 20％的碘化鉀溶液，混勻，離心。上清液轉入供滴定用的100ml玻璃管中，沉淀在攪動情況下以10ml水沖洗。離心后溶液與一次離心液合并。向得到的溶液中加入0.5ml淀粉液，用1mmol/L KIO3滴定，直至出現不消失的藍色為止。1ml 1 mmol/L 的KIO3相當于0.307mg谷胱甘肽。（參考《現代植物生理學實驗指南》，科學院上海植物生理研究所編）。
3 硝酸還原酶(NR)的測定采用離體法：（1g樣）（參考陳建勛，王曉峰主編的《植物生理學實驗指導》,P27～29）
亞硝酸鈉標準溶液（1µg/ml）：稱NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml，再吸5ml定容到1000ml。
0.1 mol/L pH7.5的磷酸緩沖溶液：30.0905g Na2HPO4·12H2O + 2.4965g NaH2PO4·2H2O，加蒸餾水定容到1000ml。
3mol/L HCl：125ml濃鹽酸加蒸餾水定容到500ml。
1％ 磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中。
0.2％ a-萘胺溶液：1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸餾水定容到500ml，貯于棕色瓶中。
0.1mol/L KNO3溶液：5.055g KNO3溶于500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸緩沖溶液。
0.025mol/L pH8.7的磷酸緩沖溶液：Na2HPO4·12H2O 8.8640g + NaH2PO4·2H2O 0.0570g，加蒸餾水定容到1L。
提取緩沖液：1.211g半胱氨酸 + 0.372g EDTA，溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的磷酸緩沖溶液。
2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH溶于250ml 0.1 mol/L pH7.5的磷酸緩沖溶液（臨用前配制）。
先標制作準曲線:
取7支潔凈烘干的15ml刻度試管加試劑，即配成0～2.0μg的系列標準亞硝態氮溶液。搖勻后在30℃保溫箱或恒溫水浴中保溫30min，然后在540nm波長下比色。以亞硝態氮（μg）為橫坐標（x），光密度值為縱坐標（y）繪標準曲線或建立回歸方程。
各試劑加入順序
|
管 號 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
亞硝酸鈉標準液(ml) |
0 |
0.2 |
0.4 |
0.8 |
1.2 |
1.6 |
2.0 |
|
蒸餾水(ml) |
2.0 |
1.8 |
1.6 |
1.2 |
0.8 |
0.4 |
0 |
|
1％ 磺胺溶液(ml) |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
|
0.2%α-萘胺(ml) |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
|
每管含NO2- (μg) |
0 |
0.2 |
0.4 |
0.8 |
1.2 |
1.6 |
2.0 |
1g 材料+15ml提取緩沖液后研磨勻漿，轉移到離心管中于4℃、4000r/min下離心15min,上清液即為粗酶提取液，用于硝酸還原酶(NR)的測定。
0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3溶液 + 0.4mlNADH溶液后混勻（對照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1mol/L pH 7.5磷酸緩沖液代替），在25℃水浴中保溫30min。保溫結束后立即加入1ml磺胺溶液終止酶反應，再加1ml 0.2％ a-萘胺溶液，顯色反應15min后于4000r/min下離心5min，取上清液在540nm下比色測定吸光度。根據回歸方程計算。
