PCR級柱式動物線粒體DNAout
發布日期：2013-06-27 瀏覽次數 ：1126
PCR級柱式動物線粒體DNAout
產品及特點 線粒體DNA（mtDNA）是進行分子進化研究和母性遺傳研究的重要材料，但傳統的兩步式mtDNA提取方法是先溫和裂解細胞，分離線粒體，然后再從線粒體中提取mtDNA。此方法中的溫和裂解細胞的條件十分難以控制，需要針對不同組織材料單獨進行優化。本方法克服了上述缺點，具有下列優點：
1. 不需要單獨純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。
2. 得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。
3. 每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3-5 ug mtDNA。
4. 注意：本產品只適合于動物材料，不適合于植物材料，因為植物線粒體DNA一般都十分巨大，非常難提。
規格及成分 成 份 50次包裝
溶液A 13 mL
溶液B 13 mL
溶液C 18 mL
離心吸附柱 50 套
通用洗柱液 50 mL
DNA洗脫液 10 mL
使用手冊 1份
運輸及保存 常溫運輸，短期可以在室溫放置；長期保存放4℃。
自備試劑 無
使用方法 一：培養細胞預處理
1. 用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個培養細胞，離心收集后棄上清。
2. 用PBS或TBS等緩沖液洗滌細胞兩次，離心得到的細胞沉淀直接用于mtDNA提取。
二：組織細胞預處理
3. 用剪刀將1g新鮮的動物組織剪碎（芝麻大?。?，轉移到1.5mL塑料離心管中，用于mtDNA提取。注意：不要使用凍存的動物組織，因為凍凝過程中形成的冰晶會將線粒體刺破，使其DNA釋放出來被胞漿中的DNA酶降解，影響回收率。
三：血液預處理
4. 將3-5 mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘，取白細胞層。
5. 用自備PBS洗滌白細胞兩次，得到的白細胞沉淀用于mtDNA提取。
四：mtDNA提取
5. 在細胞沉淀或剪碎的組織中加入250 uL冰浴的溶液A，充分吹打分散。如果是剪碎的組織，不要等成塊的組織溶解即可繼續下步操作。
6. 加入250 uL常溫的溶液B（如果溶液B有沉淀，用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用），溫和反復顛倒混勻10次。千萬不要劇烈振蕩。
7. 冰上放置6-8分鐘。注意不要超過8分鐘。
8. 加入350 uL冰浴的溶液C，溫和混勻4-6次，可見白色沉淀物產生，然后放冰上放置20-25分鐘。
9. 室溫12000-15000 g離心10分鐘，小心將上清液轉移到離心吸附柱中。由于此時的溶液比重較大，有時候出現沉淀漂浮是正?，F象，取上清時避開漂浮的沉淀即可。
10. 靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結合，此步十分重要。
11. 室溫12000-15000 g離心1分鐘，棄收集管中的廢液。
12. 加入500 uL的通用洗柱液，室溫12000-15000 g離心1分鐘，棄收集管中廢液。注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要將蓋擰緊存放，否則乙醇會揮發。
13. 重復上步1次。
14. 室溫12000-15000 g離心1分鐘，甩干殘留液體。此步不能省略，否則殘留乙醇會影響DNA的后續使用（如DNA上樣時不能沉淀到加樣孔中）。
15. 將離心吸附柱置于一個新的1.5 mL塑料離心管中，加入30-50 uL 65-80℃預熱的DNA洗脫液，室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫，但產量稍微有所降低。
16. 室溫12000-15000 g離心1分鐘，離心管底溶液即mtDNA。
17. 由于本公司離心吸附柱結合DNA能力較強，如果再加30-50 uL DNA洗脫液到離心吸附柱中，往往還能洗脫下很多mtDNA（相當于一次洗脫的20-30%），但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來洗脫。
18. 12000-15000 g離心1分鐘，離心管底溶液即線粒體DNA。每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3-5 ug mtDNA。如果DNA需要濃縮，可以使用本公司的核酸濃縮劑。
19. 由于DNA機械斷裂，電泳時DNA可能不呈現專一的帶，但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。
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