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價格：電議
所在地：北京
型號：HR8045-50T
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更新時間：2023-05-31
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公司地址：北京市海淀區紫雀路33號院3號樓
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王欣(女士) （來電時請說是從給覽網看到我的)
產品特點：
● 使用方便。
● 含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。
● 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。
● 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
試劑盒以外自備試劑耗材和儀器：
● 離心機 ● 振蕩器 ● 勻漿機/Dounce勻漿器 ● 渦旋混勻器 ● 100μm細胞篩
● PBS ● 蛋白定量試劑盒
使用注意事項：
● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
● 實驗過程中的所有試劑須預冷；所有器具須放-20℃冰箱預冷。整個過程須保持樣品處于低溫。
● 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。
● 可以根據自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。
使用方法：
1、提取液制備：
每200μL提取液C中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
【注】：
● 根據需要處理的樣品數量準備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。
● 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。
● 以下步驟中使用的蛋白提取液C為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。
2、取洗凈擦干后并去除葉梗和粗脈的200-500mg植物葉片組織樣本用手術剪刀盡可能剪碎。
【注】：
● 也可用刀片將葉片樣本切成小塊。用鋒利的手術刀片切成0.5mm*0.5mm細塊。
3、加入1-2mL PBS后用勻漿機充分勻漿或者加適量PBS 后用勻漿器充分勻漿。
4、將勻漿液用100μm細胞篩過濾；
【注】：
● 沒有細胞篩的話，在4℃，稍微靜置，讓粗纖維，成團組織塊等沉降，或者以低于100×g力條件下離心1分鐘，收集細胞上清，棄組織沉淀。
● 有些含黏液較多的樣品可能難以吸取，可以將1mL吸頭尖稍微剪掉一點使用。
5、將濾液在2000×g條件下離心10分鐘，棄上清，收集沉淀。
6、在沉淀中加入500μL提取液A，充分混勻。
【注】：
● 培養細胞1000×g條件下離心5分鐘，小心吸取培養基，盡可能吸干，收集細胞后用PBS洗滌2次，然后直接加入提取液A重懸。
● 大約每300μL細胞沉淀體積中加入1mL提取液A。
● 一般加入樣本體積的2-3倍體積的提取液A，充分淹沒樣本即可。
7、將細胞懸液置振蕩器上37℃振蕩12-72小時。
【注】：
● 使用振蕩器/搖床的較低轉速，提取液能輕微晃動即可。
● 沒有振蕩條件也可以不振蕩，中間每隔幾小時用移液器吹打混勻即可。
● 不同類型的植物樣本需要處理的時間差異較大。擬南芥較易處理，鮮嫩葉片較易處理，年齡小的樣本處理時間短。擬南芥嫩葉最短4小時即可。
● 部分細胞壁較厚的植物類型可能需要處理更長時間?？梢匝娱L至12小時以上過夜處理以提高核蛋白得率。
8、在2000×g條件下離心10分鐘，棄上清，收集沉淀。
9、在沉淀中加入1mL提取液B，用勻漿器充分勻漿。
10、置振蕩器振蕩15分鐘。
【注】：
● 使用振蕩器/搖床的較低轉速，提取液能輕微晃動即可。
● 沒有振蕩條件也可以不振蕩，置4℃靜置，稍微延長處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。
11、在2000×g條件下離心10分鐘，棄上清，收集沉淀。
12、在沉淀中加入100-200μL冷的提取液C，充分混勻。
13、置4℃振蕩20-40分鐘。
【注】：
● 使用振蕩器/搖床的較低轉速，提取液能輕微晃動即可。
● 沒有振蕩條件也可以不振蕩，置4℃靜置，稍微延長處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。
14、在4℃，12000×g條件下離心5分鐘。
15、將上清吸入另一預冷的干凈離心管，即可得到核蛋白。
16、將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存備用或直接用于下游實驗。
【注】：
● 建議用BCA 法進行蛋白定量。相關產品：HR0329。
● 蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。
常見問題分析：
● 蛋白濃度低？
植物核蛋白豐度比較低，在條件允許的情況下，盡可能增加樣本量。
處理部分樣本時可能沒有裂解完全，導致蛋白濃度低。只要適當增加試劑A 的勻漿次數，并適當延長試劑A 和B 的處理時間即可。最好在持續振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。
● 用什么方法定量蛋白？
建議用BCA 法。不適合用Bradford法，因為試劑A中含有干擾Bradford法的組份，導致定量不準。如果已經進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。
● 提取時出現膠狀沉淀？
蛋白提取液處理產物中有時會出現少量透明膠狀物，屬正?，F象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復合物。不檢測和基因組DNA結合特別緊密的特定蛋白的情況下，可以直接離心取上清進行后續實驗即可；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理，300w/10秒間隔10秒，超聲3分鐘，隨后離心取上清用于后續實驗。
● 提取的蛋白具有活性嗎？
本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結構，沒有對蛋白質之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構象和活性。
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