F03細胞內鈣離子染色試劑盒是利用F系列Ca2+鈣離子熒光探針進行鈣離子特異性染色的試劑盒。本試劑盒中的F03細胞內鈣離子染色探針為綠色熒光標記的鈣離子探針,具有505/525nm的最大激發(fā)/發(fā)射波長。

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檢測方法：

● 流式細胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細胞 ● 貼壁細胞

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 熒光顯微鏡/激光共聚焦/流式細胞儀 ● 離心機 ● 移液器 ● PBS ● HBSS

使用注意事項：

● 螺旋蓋微量試劑管裝試劑開蓋前請短暫離心,將蓋內壁上的液體收集至管底,避免開蓋時液體灑落。

● F03染色液為DMSO溶液,冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài),極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解,吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預熱,否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

● 用前,將本品取出回溫至室溫,并對其進行簡短離心使DMSO溶液集中于管底。

● 細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

● 染色后立即進行分析。

● 本染色液可用于細胞涂片、細胞的檢測。

● F03探針在水中的穩(wěn)定性比較差,染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用,并且在當天用完。

● F03探針對濕度比較敏感,每次取完需要量后,必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量,分裝密閉保存。不可使用含水的吸頭。

● 試劑A母液請擰緊螺旋蓋,避免受潮失效。

● 可在染色溶液中加入等體積的20% Pluronic F127溶液（可選步驟）,Pluronic F127可以幫助F03更快進入細胞,不建議在Pluronic F127中長期保存F03溶液。

● 標記條件因細胞的種類而異,據(jù)不同樣本實際染色結果做相應調整,每次正式實驗前先摸索一下細胞量、鈣離子熒光探針的終濃度、培養(yǎng)時間等,找到最佳實驗條件。以下方法僅供參考。

使用方法：

1、染色工作液的配制：

根據(jù)樣本數(shù)量,用37℃培養(yǎng)箱預熱的HBSS將F03熒光染料200-1000倍稀釋,配制成染色工作液。

【注】：

● 也可以用相應的無血清培養(yǎng)基稀釋F03染料至所需濃度。

● 開始實驗前,使用HBSS緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋染料儲存液到需要的工作濃度。工作濃度應根據(jù)不同細胞的預實驗結果確定的最佳工作濃度,建議至少在超過10倍范圍的濃度下進行測試。一般染色終濃度500-1000倍稀釋,500-1000倍適合大多數(shù)細胞樣本。

● 建議收到產品后,根據(jù)單次使用量,對母液進行小量分裝,每次使用一管,試劑-20℃避光保存,一年穩(wěn)定。

● 工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用,避免反復凍存。

● 為了降低探針加載過度可能引起的假陽性,建議在不影響染色效果的情況下盡量使用低濃度。

● 若細胞在染色后不含染料的培養(yǎng)基中孵育,熒光信號會衰減。

2、細胞染色

懸浮細胞染色

（1）用PBS洗滌細胞2次。

【注】：

● 500×g離心5分鐘。根據(jù)實驗室平時離心細胞的離心力離心。

（2）加入適量體積的染色工作液重懸細胞,使其密度大約為1×10⁶/mL。

（3）在37℃孵育細胞20分鐘,不同的細胞最佳培養(yǎng)時間不同。可以用20分鐘作為起始孵育時間,之后優(yōu)化體系以得到均一的標記結果。

【注】：

● 若染色不夠充分,建議增加染料濃度或延長染色時間。

（4）加入5倍體積的含有1%胎牛血清的HBSS,再繼續(xù)孵育40分鐘。

（5）孵育結束,500×g離心5分鐘。

【注】：

● 以下步驟均為洗滌細胞。根據(jù)實驗室平時離心細胞的離心力和時間進行離心。

（6）棄上清液,再次緩慢加入37℃預熱的HBSS重懸細胞。

（7）重復（5）,（6）步驟兩次。

（8）加入HBSS重懸細胞,在37℃下再繼續(xù)孵育20分鐘。

（9）然后用該細胞進行熒光鈣離子檢測。

貼壁細胞染色

（1）用PBS洗滌細胞2次。

（2）細胞培養(yǎng)板中或細胞爬片上加入適量體積的染色工作液。

【注】：

● 96孔細胞培養(yǎng)板每孔加入100μL染色液即可。

（3）37℃孵育細胞20-60分鐘,不同的細胞最佳培養(yǎng)時間不同。可以用20分鐘作為起始孵育時間,之后優(yōu)化體系以得到均一的標記結果。

【注】：

● 若染色不夠充分,建議增加染料濃度或延長染色時間。

（4）吸干染色工作液,用HBSS洗培養(yǎng)板或蓋玻片2-3次,每次用預熱的HBSS覆蓋所有細胞,然后吸干培養(yǎng)基。

（5）加入HBSS,在37℃下再繼續(xù)孵育20分鐘。

（6）然后用該細胞進行熒光鈣離子檢測。

3、用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測。

激發(fā)波長為488nm,最大發(fā)射波長為525nm。

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