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價格：電議
所在地：北京
型號：HR9100-20T
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更新時間：2023-05-31
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公司地址：北京市海淀區紫雀路33號院3號樓
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王欣(女士) （來電時請說是從給覽網看到我的)
產品特點：
● 使用方便，無需超速離心，省時省力；
● 純度高，富集量大，應用范圍廣；
● 獲取的Exosome結構和功能完整；
● 穩定性好，便于運輸，便于保存。
試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：
● 離心機 ● 移液器 ● PBS或者HBSS ● 純水
使用注意事項：
● 可以根據自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑。
● 以下以4ml培養基為例，實際操作時按培養基和提取液A用量體積比4：1使用即可。
● 不同細胞分泌的囊泡數量差異極大，請根據實際情況選擇培養基樣品的量，根據下游應用和參考文獻確定。條件允許的情況下采用盡可能多的細胞培養上清。
● 一般巨噬細胞、淋巴細胞、造血細胞、胰腺癌細胞等分泌囊泡較多，其它細胞樣本建議每個樣培養基上清用量不少于8ml。常規的細胞樣本最佳培養上清上樣量為15-20ml及以上，條件允許的情況下采用盡可能多的細胞培養上清。
● 條件允許的情況下可以將細胞培養上清濃縮后再提取囊泡。
● 在收獲細胞時，應確定死亡細胞不超過5%。細胞凋亡/死亡過程中會釋放大量大小不等的囊泡，它們在囊泡的提取過程中會污染活細胞產生的囊泡。
● 已經分離好的囊泡樣本如果需要進行電鏡觀察，只能冰上或4℃保存，存放時間不超過兩天，注意不可冷凍保存，否則可能會影響電鏡觀察效果。
使用方法：
囊泡提取：
1、收集4ml待提取的培養基樣品，置2-8℃保存。
【注】：
● 凍存樣品置水浴鍋解凍后置2-8℃保存。
2、將樣品在4℃條件下，3000×g離心15分鐘。棄沉淀，收集上清。
3、小心將上清移入另一干凈離心管中。
4、將樣品在4℃條件下，10000×g離心20分鐘。棄沉淀，收集上清。
5、小心將上清移入另一干凈離心管中。
6、在4ml上清中加入1ml提取液A，蓋緊離心管蓋，上下顛倒混勻1分鐘左右，使液體充分混勻。
【注】：
● 試劑A使用前請充分混勻。
7、置2-8℃冰箱靜置過夜。
【注】：
● 靜置保存時間不少于10小時。
8、在4℃條件下，10000×g離心60分鐘。
9、小心移除上清，收集沉淀。
【注】：
● 盡可能吸干上清。
● 吸取時小心，防止吸掉沉淀。
10、取500μL囊泡保存液將沉淀重懸，用移液器輕輕吹打混勻，得到囊泡沉淀重懸液，進行下列囊泡純化步驟操作。
清洗囊泡純化離心管：
1、用緩沖液或純水進行預清洗。
2、離心管中的過濾膜一旦潤濕后應避免變干。如果在預清洗后不是立即使用，則讓液體保留在濾膜上，直到使用。
【注】：
● 可以在囊泡提取步驟中需要使用前再清洗。
● 重復使用時要仔細檢查管壁上有沒有裂紋。
囊泡純化：
1、將囊泡純化離心管內管插入所提供的一個微量離心管中。
2、向內管中加入過500μL的囊泡沉淀重懸液樣本，并蓋上蓋子。
【注】：
● 用吸頭伸入內管中時，必須防止碰到濾膜，以免戳破濾膜。
● 加囊泡懸液或Buffer到內管時，可以用藍吸頭；但從內管管底吸取純化好的囊泡時，必須用黃吸頭。
3、將蓋好蓋子的囊泡純化離心管放入離心轉子中，讓蓋子的連接帶朝著轉子的中央；用一個類似的離心管平衡。
4、以5000-8000×g離心約10-15分鐘。離心至大約剩余50μL-100μL液體。
【注】：
● 離心至大約剩余50μL-100μL液體即可，不要過度濃縮。
● 如果囊泡樣本的起始濃度很高，請監控離心過程，以免樣本過度濃縮。過度濃縮會導致沉淀，這也可能帶來樣本損失。第一次做新樣品時，可以離心幾分鐘后觀察剩余液體大概體積。
● 建議將濾過液吸入1.5ml帶蓋的離心管（自備）中保存，一直保留到囊泡的樣品分析測試完成。避免吸頭戳破濾膜導致囊泡損失。
● 影響流速的因素包括樣本濃度、相對離心力、離心轉子的角度以及溫度。500μL樣本的典型離心時間大約是10至20分鐘。大部分樣本在離心開始后的前5至10分鐘發生過濾純化，但在離心10至30分鐘后才能達到最低的純化液體積（20μL）。
● 可以將濃縮的囊泡用PBS或HEPES等緩沖液（根據下游實驗需要選擇）稀釋，再次離心至大約剩余50μL-100μL，這樣的囊泡純度將再次提高，殘余的外源蛋白質和核酸更少。
5、離心結束后將整個離心管從離心機中取出，取出內管。
【注】：
● 囊泡可能會有少量的吸附損失，吸附損失取決于囊泡濃度、與過濾純化內管表面接觸的溫度和時間。為了最大限度降低損失，離心后請立即回收過濾后的囊泡樣本。
6、為了回收純化后的囊泡，將內管倒過來插在另一個干凈的微量離心管中。放在離心機中，讓打開的蓋子朝著轉子的中央；用一個類似的離心管進行平衡。
7、以1000×g離心2分鐘，使純化后的囊泡樣本從純化內管轉移到收集管中。
【注】：
● 要達到理想的回收效果，請盡早進行倒置離心。
● 也可不倒置離心，直接用移液器直接吸出內管中的樣品。
● 從內管管底吸取純化好的囊泡時，必須用黃吸頭。
● 用吸頭伸入內管中時，必須防止碰到濾膜，以免戳破濾膜。
8、吸取收集管中的液體，即得到囊泡樣品純品。
【注】：
● 可以根據下游實驗需要，用相應的緩沖液稀釋保存囊泡。
● 也可直接用于蛋白提取。
● 將囊泡樣本-80℃保存或直接用于下游應用。
● 囊泡短期保存可以置于2-8℃保存即可，一周以上長期不用時置-80℃保存。
● 保存前可以用0.22μm或0.35μm濾器過濾除菌。
9、用純水或緩沖液洗滌內管和收集管，繼續純化下一個樣品。
【注】：
● 洗滌內管時，加入400μL PBS緩沖液或其它緩沖液，用吸頭反復吹打，吸掉緩沖液即可。
● 用PBS洗滌3-4次。
● 用吸頭伸入內管中時，必須防止碰到濾膜，以免戳破濾膜。
● 每個離心管內管建議重復使用5次，不要超過10次。
● 加囊泡懸液或Buffer到內管時，可以用藍吸頭；但從內管管底吸取純化好的囊泡時，必須用黃吸頭。
● 如果使用過的離心管需要長期保存，可以按下列方法清洗和保存離心管內管。
囊泡純化離心管清洗和保存：
1、使用后用水沖洗干凈；
2、內管加入超純水500μL，5000×g 離心5分鐘；
3、吸凈內管中的水，加入500μL 0.1M NaOH，5000×g離心20分鐘；
4、用0.1M NaOH浸泡24小時；
5、用水沖洗干凈；
6、用無菌水浸泡2-8℃保存。
7、外管用自來水洗凈后，用超純水沖洗干凈，晾干。
【注】：
● 1個月不用的話，直接用100mM的NaOH保存！更長時間的話加0.02%的疊氮鈉。
● 再次使用前，用純水充分沖洗干凈，然后根據下游實驗需要，用相應的緩沖液平衡。
常見問題分析：
● 培養細胞時，如何去除血清來源的囊泡？
多數情況下，細胞在體外培時養需要血清，而血清中一般都含有囊泡，為避免血清對細胞囊泡的污染，可采用以下方法：（1）將細胞培養用的血清通過100000×g超速離心10小時以上以去除血清囊泡；（2）選擇無血清培養基進行細胞培養。
● 無囊泡血清培養基（或者無血清培養基）在什么時候使用？
細胞在正常含血清的培養基中培養一定的時間后，細胞融合度約為60%-70%時，移去原有含血清的培養基，換成新鮮的無囊泡血清培養基（或者無血清培養基），繼續培養24-48h，細胞融合度達到80%-95%左右時收取上清,該上清液即可用于提取細胞外囊泡。
● 蛋白濃度低？
很多細胞外囊泡量不夠下游應用，在條件允許的情況請盡可能加大培養上清的上樣量。
處理部分樣本時可能沒有裂解完全，導致蛋白濃度低。請選擇高質量的蛋白裂解液或蛋白提取試劑盒。
● 囊泡純化管內管膜會因為離心時間過長而變干么？
不會，因為內管有死體積，總會有溶液殘留在內管中。死體積大約10-20μL。
● 可以重復使用過濾管么？
可以重復使用。如果使用、清洗、保存得當，可以反復使用多次。但是超過8次重復使用后過濾膜有破損風險，注意使用過程中盡量避免尖銳物品戳到膜。離心力不要過大。
● 囊泡在純化時出現了沉淀，如何改進？
如果過濾過快或者過度濃縮都有可能引起沉淀。如果樣品的囊泡濃度很高，建議降低最終的囊泡濃度，保留更多的液體。
對于因過濾速度敏感而導致的沉淀，建議的改進方法是：
1）離心力降低30%-50%
2）在過濾過程中取出過濾管，用槍頭反復吹吸幾次。
● 有時候用囊泡純化離心管連水都離不下來，可能是什么原因？
如果出現這種情況，可能時過濾膜的孔被堵住。請先用0.1M NaOH清洗再離心。
最后用緩沖液或純水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應立即使用，如暫時不用，請保持潤濕狀態，避免重新干燥。
● 說明書中推薦在室溫下進行離心，考慮到囊泡的穩定性，是否可以在4℃進行離心？
可以，但是低溫可能會增加囊泡樣品的粘性，導致流速減慢，建議可將離心時間延長。
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