本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。本試劑盒提取的蛋白樣本含高濃度鹽成分，不可直接用于2D電泳，需除鹽后再用于2D電泳。如下游實(shí)驗(yàn)需直接用于等電聚焦、雙向電泳，請使用我司其他貨號試劑盒。也可以用脫鹽柱脫鹽處理。

北京百奧萊博科技有限公司是一家專業(yè)的生物試劑銷售公司。公司主要經(jīng)營血清、抗原、抗體等生物試劑產(chǎn)品，可以為您提供專業(yè)的技術(shù)服務(wù)，以優(yōu)良的價格、優(yōu)質(zhì)的服務(wù)、優(yōu)先的理念，滿足客戶的各方面的需求，與國內(nèi)多家企業(yè)、單位建立了良好的長期合作關(guān)系，擁有較好的企業(yè)信譽(yù)和品牌形象。 主營產(chǎn)品:血清、抗體、抗原、核酸提取、核酸純化等生化試劑

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、使用方便。

2、含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

3、紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

4、蛋白酶抑制劑抑制了蛋白降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化組成使其可抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

5、本品不含EDTA，可以用于金屬螯合層析等下游應(yīng)用。

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 離心機(jī) ● 振蕩器 ● 渦旋混勻器 ● 移液器 ● PBS ● 蛋白定量試劑盒

注意事項(xiàng)：

● 旋帽離心管裝試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 實(shí)驗(yàn)過程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個過程須保持樣品處于低溫。

● 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

● 可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

使用方法：

1、提取液準(zhǔn)備：

每500μL提取液A 中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，充分混勻后置冰上備用。

【注】：

● 根據(jù)需要處理的樣品數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

● 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

● 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2、收集待提取菌體，用PBS洗菌體2次。

3、按每50-150mg濕重菌體樣本加入500μL提取液A（大約菌體和提取液體積比1:2-1:5，完全淹沒菌體即可），吹打混勻，在2-8℃振蕩30分鐘-1小時。

【注】：

● 此步驟必須在2-8℃條件下振蕩，不可室溫處理。

● 裂解液用量并不是一定的，請根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。

● 細(xì)菌外膜蛋白豐度極低，需要保證足夠的菌體上樣量才能提到足夠蛋白，在條件允許的情況下，請盡可能加大菌體上樣量。

● 如果沒有2-8℃振蕩條件，可以在2-8℃靜置，稍微延長試劑A處理時間，中間每隔10分鐘用移液器吹打混勻。

4、將提取液在2-8℃下12000×g力離心5分鐘，取上清。

5、將上清液在37℃水浴10分鐘。

6、在37℃ 500-1000×g力離心3 分鐘。

【注】：

● 此步驟必須37℃條件下離心。

● 如果離心機(jī)不可控溫，可以不離心，延長上一步驟水浴時間，至溶液分層清晰即可。或者在室溫條件下離心，縮短離心時間至1分鐘。

7、此時液體分為2層，小心移除上層溶液，留管底部下層大約30-50μL液體。

【注】：

● 下層為粘稠狀液體。

8、用50-150μL冷的膜蛋白溶解液B溶解該溶液，即得細(xì)菌外膜蛋白樣品。

9、將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。

【注】：

● 建議用BCA法進(jìn)行蛋白定量。相關(guān)產(chǎn)品：HR0329。

● 蛋白樣品-80℃存放一年沒問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

● 可以用溶解液C或者其他合適緩沖液如PBS調(diào)整蛋白濃度。

常見問題分析：

● 蛋白濃度低？

膜蛋白豐度較低，需要盡可能加大細(xì)胞上樣量。處理部分組織樣本時可能沒有裂解完全，導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當(dāng)延長試劑A的處理時間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。也可以用蛋白濃縮柱進(jìn)行濃縮處理（相關(guān)產(chǎn)品HR0388）。

● 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford法，因?yàn)樵噭〢中含有干擾Bradford法的組份，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

● 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒有對蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。

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