Bradford法（考馬斯亮藍法），是目前靈敏度最高的蛋白質測定法之一。當Bradford 染色液（考馬斯亮藍G250）和蛋白在酸性條件下結合時，溶液顏色由棕黑色轉為藍色，最大吸光值波長由456nm 轉至595nm，吸光值與蛋白質的含量在一定濃度范圍內有較好的線性關系，通過測定吸光值大小并對照標準蛋白的吸光值，推算出蛋白濃度，實現

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試劑盒以外自備試劑和儀器：

●分光光度計 ●酶標儀 ● 移液器 ● 純水

注意事項：

● Bradford法對于去污劑敏感的，受高濃度去垢劑影響。需確保SDS低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween 20,60,80低于0.06%。含去垢劑的樣品推薦使用我公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒。

● 染色液使用前請混勻。

● 將G250染色液放置到室溫再使用，有利于提高檢測的靈敏度。

● 由于Bradford法在蛋白濃度增高到一定時候，顏色反應并不成比例增加，因此得到的標準曲線只是在一定范圍內可以近似看成直線，每次應按照實際測得的標準曲線計算出相對精確的蛋白濃度。

● 反應在5分鐘后顯色充分，但在10分鐘后可能開始出現沉淀，故建議在加入染色液后5-10分鐘內完成檢測，誤差較小。

● 最好使用塑料比色皿，如使用玻璃比色皿或石英比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇清洗。

使用方法：

A、96孔酶標板測定：

1、蛋白標準工作液配制：

根據樣品數量配制相應體積的蛋白標準工作液。將蛋白標準儲存液用雙蒸水5 倍稀釋，配成1mg/mL的工作液。

2、標準曲線繪制。

取一塊酶標板，按以下表格數據加入試劑：

3、振蕩混勻后，室溫放置5-10分鐘。

4、用酶標儀測定A₅₉₅，以不含BSA的光吸收值為空白對照。

5、以蛋白含量（μg）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線。

6、樣品測定：

將待測蛋白樣品用去離子水稀釋至適當濃度，取10μL樣品，加入100μL 2×Bradford染色液和90μL的純水，混勻后放置5-10分鐘，然后以0號孔為對照，測定樣品吸收值A₅₉₅。

【注】：

● 必須用純水補足體積，不能用PBS等buffer。

7、根據測得的吸收值，在標準曲線上即可查得樣品的蛋白含量。

8、計算蛋白濃度：

以查得的蛋白含量除以樣品體積10μL，再乘以相應的稀釋倍數即可得到待測樣品的實際濃度。

B、比色皿測定

按照比色皿規格，與以上方法相同，適當按比例增加各溶液體積即可。

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